Enregistrements tableau multi-électrodes des Avalanches neuronale dans des cultures organotypiques

L'objectif de cette expérience est d'étudier l'auto-organisation de l'activité cérébrale saine en avalanches neuronales, caractéristique des dynamiques à état critique dans le cortex. Cela est réalisé en combinant une tranche corticale coronale stratifiée avec une tranche de mésencéphale, qui fournit des entrées dopaminergiques importantes sur le plan développemental au cortex. Dans un deuxième temps, la culture mixte cortex-mésencéphale est cultivée sur une matrice multielectrode, ce qui permet de stimuler et d'enregistrer l'activité neuronale à plusieurs sites dans la culture.

Ensuite, nous laissons la co-culture s'aplatir, s'étendre et s'attacher à la surface de la MEA pendant les une à deux premières semaines dans un incubateur conçu sur mesure, qui soumet la culture à des cycles d'exposition à l'air ambiant et au milieu de culture. Des résultats fluides sont obtenus, montrant l'auto-organisation spontanée de décharges de potentiels de champ locaux spatio-temporels en avalanches neuronales. Ces résultats sont basés sur des enregistrements à l'aide de la MEA et une analyse hors ligne des avalanches permettant d'identifier la loi de puissance dans les tailles d'avalanches.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les cultures dissociées, réside dans son aspect systémique et en neurosciences. Nous pouvons réaliser des co-cultures de nombreuses régions cérébrales simultanément, et ces cultures multi-régionales établissent une organisation cérébrale correcte à grande échelle, comme les couches corticales et les systèmes de projections. Les applications de cette technique vont au-delà de l'étude des avalanches neuronales.

Par exemple, nous pouvons étudier le stimulus en réponse au niveau du réseau dans des conditions in vitro rigoureusement contrôlées. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car l'application correcte du mélange de thrombine plasmatique et le positionnement du tissu sur la MEA sont difficiles à maîtriser. Ces étapes exigent un chronométrage approprié, un gradient de température adéquat et l'évitement de tout contact direct avec la surface délicate de la MEA.

Pour préparer une chambre en verre stérile et hermétique destinée aux enregistrements, commencez par couper des cylindres en verre filetés munis d'un bouchon en plastique en téflon, à environ deux millimètres du bas du filetage. Ces pièces sont nécessaires pour assurer une fermeture étanche et sécurisée de la chambre de culture. Ensuite, nettoyez les anneaux de verre en les rinçant trois fois à l'eau, puis en les faisant bouillir pendant cinq minutes dans de l'alcool éthylique à 200 degrés.

Mettez-les de côté pour les faire sécher, car une solution de silicone est nécessaire pour fixer les anneaux de verre à la surface de la MEA. Utilisez un kit de caoutchouc de silicone Cell Guard 180 4 et mélangez soigneusement 15 millilitres des composants A et B. Laissez ensuite reposer pendant 15 minutes afin d'éliminer les bulles d'air.

Séparez la solution en une prise d’un millilitre d’Eloqua, puis stockez-la à moins 20 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Collez maintenant un anneau en verre sur la MEA en prélevant un millilitre de silicone à 23 degrés Celsius dans une seringue munie d’une aiguille de petit calibre, puis en l’appliquant sur la surface coupée non polie de l’anneau en verre. Centrez ensuite l’anneau en verre sur la MEA et appliquez une couche supplémentaire de silicone autour de l’extérieur de l’anneau afin d’obtenir un joint plus étanche.

Laisser polymériser pendant une à deux heures à environ 60 degrés Celsius sur un agitateur chauffant. Ensuite, stériliser la chambre MEA et les bouchons de chambre sous hotte à flux laminaire en rinçant trois fois avec de l'eau déionisée, puis trois fois avec de l'alcool à 70 % pour le dernier rinçage. Laisser la chambre en contact avec l'alcool pendant 10 minutes.

Procéder ensuite à l'exposition de la chambre et de l'intérieur du bouchon à la lumière UV pendant 10 minutes. Stériliser en autoclave à 120 degrés Celsius pendant 45 minutes. Une fois stérilisés, laisser ces éléments sécher.

Recouvrez maintenant la surface de la MEA à l'intérieur de la chambre de culture avec de la poly-D-lysine. Les nouvelles MEAs utilisées dans cette expérience sont plutôt lipophiles ; appliquez donc le revêtement par ajout répété de gouttelettes. Aspirez la solution à partir de la grille d'électrodes.

Fixer le bouchon afin de sceller la chambre MEA pour le stockage et une utilisation ultérieure. Cette procédure permet d'obtenir des sections de cortex et de VTA pour environ 12 cultures co-cultivées et doit être réalisée à l'intérieur d'une hotte à flux laminaire, en conditions stériles, en utilisant des animaux sains âgés de un à deux jours après la naissance ; le temps total de collecte des tissus ne doit pas dépasser une heure. Après la décaptitation, commencer l'extraction du cerveau en effectuant d'abord deux incisions latérales avec des ciseaux pour retirer la peau du cuir chevelu.

Retirer puis ouvrir le crâne à l’aide de ciseaux oculaires fins, en effectuant une incision sagittale médiane et une incision coronaire au niveau de la jonction entre le cortex et le cervelet. Replier les quatre lamelles osseuses pour exposer le cerveau. Ensuite, à l’aide d’une spatule aiguisée, sectionner frontalement le bulbe olfactif.

Ensuite, avancez la spatule par quarts sous le cerveau. Soulevez délicatement le cerveau hors du crâne et laissez-le glisser dans une solution de trempage refroidie pour un refroidissement rapide et un stockage temporaire.

Répétez la procédure ci-dessus pour deux cerveaux supplémentaires. Pour obtenir le tissu de la VTA, transférez les cerveaux sur une boîte de Pétri stérile et sèche. À l’aide d’une petite spatule, éliminez tout excès de liquide en faisant doucement glisser chaque cerveau latéralement d’environ un centimètre.

Ensuite, utilisez une lame de rasoir pour retirer le tronc cérébral en effectuant une coupe verticale coronaire au niveau du cervelet. Collez maintenant un bloc d'agar sur un disque de fixation afin de stabiliser mécaniquement les cerveaux pendant la procédure de découpe. Placez ensuite un fin trait de colle super glue, quelques millimètres devant le bloc d'agar sur le disque, mais évitez que la colle touche l'agar à l’aide d'une petite spatule.

Transférez et montez chaque cerveau avec le pôle frontal vers le bas. Veillez à ce que les pôles frontaux soient collés sur le disque de montage et que les faces ventrales touchent l'agar sans résidu de colle. Cela assure une stabilisation mécanique adéquate pendant la coupe et un détachement facile des tranches découpées.

Ensuite, immergez et fixez soigneusement le disque de montage avec les cerveaux montés dans un plateau vibram rempli de solution de gaze refroidie. Puis, à l’aide d’un rasoir soigneusement nettoyé, découpez des sections coronales de 400 micromètres d’épaisseur du mésencéphale à la fréquence de vibration la plus élevée et à une vitesse d’avancement relativement faible. À l’aide d’une pipette à pâtes inversée munie d’une poire d’aspiration, récupérez et transférez les tranches contenant la VTA dans des boîtes de Pétri de 35 par 10 millimètres remplies de solution de gaze stérile et refroidie destinée aux sections corticales. Répétez les étapes de découpage précédentes, mais effectuez une incision verticale entre le cortex et le cervelet, puis montez les quatre cerveaux avec le pôle frontal vers le haut.

Prélèvez environ trois tranches coronales d'une épaisseur de 350 micromètres, en commençant au niveau du striatum. À l’aide d’un microcouteau fabriqué à partir de lames de rasoir cassées, disséquez sous microscope stéréo des sections coronales d’environ deux millimètres de largeur, comprenant le cortex frontal et les régions du mésencéphale contenant la VTA. Récoltez chaque section tissulaire séparément dans de petits récipients remplis de solution de Gaze fraîchement refroidie.

Pour commencer le montage du tissu dans la chambre MEA en position initiale, placez la MEA à température ambiante sous un microscope stéréo, en mettant l'array d'électrodes au point. Ensuite, centrez une goutte de 25 microlitres de plasma sur la matrice d'électrodes propre, exempte de poussière et stérile. À l’aide d’une petite spatule, faites glisser délicatement une section de cortex et de VTA dans la goutte de plasma.

Placez maintenant la MEA sur une plaque de refroidissement et recentrez l’image. Laissez refroidir environ 15 secondes avant d’ajouter 25 microlitres de thrombine dans la goutte de plasma. Ensuite, à l’aide de la pipette de thrombine, étalez soigneusement le mélange plasma-thrombine en effectuant de petits mouvements circulaires sur toute la surface de la MEA.

Veillez à ne pas toucher directement le réseau d'électrodes fragile. Ensuite, positionnez délicatement le cortex sur le réseau, en alignant la bordure dorsale le long de la deuxième rangée d'électrodes du réseau. Ainsi, les couches superficielles en développement couvriront éventuellement le reste du réseau.

Placez ensuite la VTA adjacente à la bordure ventrale de la section corticale. Fermez maintenant le couvercle de la chambre MEA sans serrer afin de maintenir une humidité élevée. Laissez l'assemblage de culture MEA reposer environ six minutes dans la hotte à température ambiante pour permettre la coagulation par thrombine plasmatique et la rétraction.

Entre-temps, répétez la procédure pour préparer trois cultures supplémentaires. Ensuite, ajoutez soigneusement en petites gouttes 600 microlitres de milieu de culture dans les chambres de culture, à l’aide d’une seringue d’un cm³ munie d’une aiguille de calibre 25 par cinq huitièmes. Puis fermez hermétiquement la chambre MEA et placez l’ensemble de culture MEA sur le plateau de stockage oscillant à l’intérieur de l’incubateur.

Après deux jours in vitro, ajouter 10 microlitres d'inhibiteur de mitose. Ensuite, renouveler le milieu de culture à 60 % au quatrième jour in vitro, puis tous les quatre jours par la suite. Pendant la croissance normale, la culture s'aplatit considérablement et s'étend légèrement en direction dorsale.

En raison du développement de couches corticales superficielles, une culture saine est identifiée par son tissu grisâtre opaque en champ clair. Inversement, la présence de vésicules brillantes et réfléchissantes, caractéristique des cellules dégénératives mortes, indique que les cultures sont prêtes pour l'enregistrement et la stimulation environ 10 à 12 jours après leur préparation. Pour commencer une session d'enregistrement, la MEA est transférée du plateau de stockage vers le support de la tête d'enregistrement.

Pour enregistrer le potentiel de champ local ou LFP, utilisez un filtre passe-bande de un à 200 hertz. L'activité multiunitaire peut également être étudiée à l'aide d'un filtre passe-bande de 300 à 3000 hertz. L'activité spontanée saine a tendance à survenir en salves de taille et de durée variées.

Pour étudier la relation entre les potentiels de champ locaux (LFP) et l'activité unitaire, nous pouvons calculer les moyennes déclenchées par les pics de LFP. Pour ces cultures corticales, les déflexions négatives des LFP sont corrélées aux décharges neuronales afin d'enregistrer l'activité induite par un stimulus. Tout d'abord, la forme d'onde temporelle et l'amplitude des stimuli sont définies à l'aide d'un logiciel qui contrôle un générateur de stimulus.

Un paradigme de stimulation utile consiste en une impulsion unique, à onde carrée bipolaire et contrôlée en courant, neutre en charge. Ensuite, on sélectionne une électrode qui servira à délivrer les stimuli. Les réponses évoquées typiques du PCL aux stimuli présentent des allures similaires à celles des rafales d'activité spontanée.

Le circuit de balayage déconnecte les amplificateurs pendant la stimulation afin de réduire les artefacts de stimulation et d'éviter la saturation de l'amplificateur. L'électrode de stimulation nécessite plusieurs secondes pour se rétablir après la stimulation et ne peut donc pas être utilisée pour enregistrer l'activité de réponse. Sur la MEA, l'activité a tendance à apparaître sous forme d'agrégats spatiotemporels, une activation en un site étant souvent accompagnée d'une activité sur d'autres sites.

En même temps, les formes d'onde typiques du PCL pendant ces périodes d'activité sont montrées ici en superposant trois groupes survenant à plusieurs secondes d'intervalle pour chaque groupe. Des déflexions négatives du PCL peuvent être observées sur plusieurs électrodes dans une fenêtre d'une seconde lors de l'extraction des pics de PCLN qui franchissent un seuil de plusieurs écarts-types négatifs ; l'activité sous forme de temps de pics de PCLN est commodément visualisée dans un rasta où des colonnes de points représentent des PPSN quasi simultanés sur diverses électrodes. L'organisation spatiotemporelle de cette activité est plutôt complexe.

Les colonnes qui apparaissent plus ou moins homogènes à faible résolution temporelle sont composées de grappes distinctes à plus haute résolution temporelle, et ainsi de suite. L’émergence de l’espace, des grappes géotemporelles et des grappes de potentiels de champ locaux (LFP) est fortement organisée dans les réseaux corticaux. Plus précisément, cette organisation est invariante d’échelle pour les avalanches neuronales.

Cela est démontré en calculant la probabilité des tailles de groupes à une résolution temporelle donnée, Delta T. Ici, les groupes sont composés de PLSN qui surviennent dans les mêmes intervalles temporels ou dans des intervalles successifs ; lorsque la taille d'un tel groupe est exprimée par le nombre total de PLSN par groupe ou par les amplitudes intégrées de PLSN par groupe, la distribution des tailles de groupes suit une loi de puissance dont l'exposant est proche de -1,5. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de disséquer soigneusement le tissu cérébral et de cultiver des tissus sur des réseaux de microélectrodes afin d'étudier l'auto-organisation de l'activité neuronale.

Ces méthodes ont également été utilisées pour étudier la relation entre l'activité spontanée et l'activité induite par un stimulus dans les réseaux corticaux.