Techniques de laboratoire aseptiques: Méthodes de placage

[Narrateur] Ce protocole intègre la technique aseptique dans les méthodes de mise en culture utilisées pour isoler, propager ou dénombrer des microorganismes tels que les bactéries et les phages. Les procédures comprennent l’ensemencement en gerbes pour isoler des colonies bactériennes individuelles, la méthode de culture en profondeur pour déterminer la concentration de bactéries, et l’ensemencement en surface pour dénombrer les colonies bactériennes viables. Des couches d’agar molle sont utilisées pour isoler les phages et dénombrer les plaques, tandis que la culture par transfert sur empreinte permet de transférer des cellules d’une boîte à une autre selon un motif spatial identique. En fin de compte, les applications pratiques de ces techniques pour la culture de microorganismes vont de l’identification de bactéries dans divers environnements aux progrès technologiques en génétique moléculaire et aux bioessais à haut débit.

- En général, les personnes novices dans ces méthodes de culture peuvent éprouver des difficultés, car les manipulations exigent des mouvements précis et coordonnés permettant d'éviter tout contact avec des surfaces non stériles. L'apprentissage de ces procédures courantes nécessite une formation et de la pratique. Le démonstrateur de ces procédures sera mon coordonnateur de laboratoire, le Dr. Kris Reddi.

- [Narrateur] Commencez les travaux avec les microorganismes en connaissant les règles de laboratoire et les précautions de sécurité, y compris la classification des risques biologiques, la décontamination des déchets et leur élimination. Vérifiez que tous les instruments, solutions et milieux destinés aux techniques de mise en culture sont stériles. Préparez également un espace de travail dégagé. Nettoyez-le avec un désinfectant. Installez un bec Bunsen raccordé à une ligne de gaz, puis disposez les fournitures nécessaires en étiquetant correctement les matériaux. Lavez ensuite soigneusement les mains avec un savon antiseptique et de l’eau tiède. Humidifiez d’abord les mains avec de l’eau courante tiède, puis appliquez le savon et répartissez-le uniformément. Frottez vigoureusement les mains en exerçant une friction sur toutes les surfaces, y compris les pouces, le dos des doigts, le dos des mains et sous les ongles. Rincez ensuite abondamment pour éliminer tout résidu de savon, puis séchez-les avec des essuie-tout prélevés d’un distributeur. Enfin, à l’aide d’un essuie-tout propre, fermez le robinet. La technique de la stérilisation en croix vise à isoler des cultures pures de bactéries, ou colonies, à partir de populations mixtes par une simple séparation mécanique. Retirez une boîte de gélose d’un réfrigérateur à quatre degrés Celsius et laissez-la préchauffer à température ambiante. Choisissez un outil parmi les instruments disponibles pour tracer les stries sur la boîte. Assurez-vous que la boîte soit sèche et qu’il n’y ait pas de condensation sur le couvercle. Étiquetez le fond d’une boîte de gélose autour du bord. Une fois expérimenté, utilisez une seule boîte pour plusieurs échantillons. Allumez ensuite un bec Bunsen pour stériliser la boucle métallique. Commencez à trois ou quatre pouces de la boucle métallique, en plaçant le fil à l’extrémité du cône bleu, la partie la plus chaude de la flamme du bec Bunsen. Lorsque le métal devient rouge incandescent, déplacez le fil pour que la flamme atteigne progressivement la boucle. Pour refroidir la boucle, touchez le bord du milieu gélosé afin de produire un sifflement. Continuez ensuite à prélever l’inoculum sur la boucle. Soulevez la moitié inférieure de la boîte. Déplacez la boucle de l’extérieur vers le centre, en effectuant des allers-retours dans le premier quadrant de la boîte. Reposez la boîte retournée sur son couvercle. Restérilisez la boucle métallique. Tournez la boîte de Petri de 90 degrés. Touchez la boucle près de la fin de la dernière strie en utilisant un mouvement d’allers-retours, croisez la moitié terminale des stries du premier quadrant, puis progressez vers le deuxième quadrant vide. Une fois le deuxième quadrant rempli, reposez la boîte. Répétez la procédure de stérilisation pour les troisième et quatrième quadrants, en évitant tout contact avec le premier quadrant. Pour la stérilisation à l’aide d’un cure-dent stérile et plat, tenez l’extrémité étroite délicatement entre le pouce et l’annulaire, à un angle de 10 à 20 degrés par rapport au milieu, et utilisez l’extrémité large pour tracer les quadrants. Retournez la boîte sur son couvercle entre chaque quadrant et jetez le cure-dent de manière appropriée. Incubez ensuite les boîtes striées à l’envers. La méthode de la boîte versée permet de dénombrer le nombre total d’unités formant des colonies présentes à la surface et à l’intérieur de la gélose d’une seule boîte. Réglez une minuterie sur 10 minutes, puis transférez 18 millilitres de milieu gélosé fondu d’un bain-marie à 55 degrés Celsius vers un bloc chauffant à 48 degrés Celsius, et laissez équilibrer pendant 10 minutes. Étiquetez le fond d’une boîte de Petri stérile. Si nécessaire, indiquez le facteur de dilution. Versez ensuite un millilitre d’échantillon au centre de la boîte de Petri. Fermez le couvercle. Retirez le bouchon du tube de gélose fondue et passez le bord du tube ouvert dans la flamme. Versez délicatement la gélose dans la boîte de Petri. Fermez le couvercle, puis mélangez l’échantillon avec la gélose en faisant tourner doucement la boîte. Attendez 30 minutes pour permettre à la gélose de durcir. Une fois la gélose solidifiée, retournez la boîte et placez-la dans une pièce tiède. La méthode de l’ensemencement en surface vise à séparer les microorganismes contenus dans un petit volume d’échantillon afin de répartir uniformément les colonies résultantes sur la surface du milieu gélosé. Laissez une boîte atteindre l’équilibre à température ambiante et étiquetez-la correctement. Placez la boîte sur un tour. Pipetez 0,1 millilitre d’échantillon au centre de la gélose, puis fermez le couvercle. Jetez la pointe dans un récipient de déchets. Immergez la tige métallique dans un bécher contenant de l’éthanol à 70 %, en recouvrant toute la partie inférieure de l’étaleur ainsi que le premier pouce de la tige, puis laissez égoutter. Enflammez l’excès d’éthanol en passant la tige dans la flamme du bec Bunsen. Ouvrez ensuite le couvercle de la boîte de gélose et refroidissez l’étaleur en le touchant à la gélose près du bord. Faites tourner lentement le tour. En tenant délicatement l’étaleur contre la surface de la gélose, étalez progressivement l’échantillon uniformément sur toute la boîte à l’aide d’un mouvement d’allers-retours pendant que le tour tourne. Fermez le couvercle et laissez l’échantillon s’absorber complètement pendant au moins cinq minutes. Incubez ensuite la boîte retournée. Étiquetez tout d’abord la boîte de gélose correctement. Ouvrez le couvercle de la boîte de gélose. Ouvrez ensuite le récipient de billes de verre pré-stérilisées et flambez-en le bord. Versez soigneusement 10 à 12 billes de verre stériles sur une boîte de gélose. Refermez le couvercle de la boîte et flambez le bord du récipient de billes de verre avant de remettre le bouchon. Pipetez ensuite l’échantillon au centre de la gélose. En effectuant un mouvement horizontal, secouez doucement les billes sur la surface de la gélose sept fois. Si l’opération est correctement réalisée, le bruit ressemble à celui d’un hochet. Tournez la boîte de 60 degrés et secouez horizontalement à nouveau sept fois. Tournez encore la boîte de 60 degrés et répétez la secousse. Vérifiez que l’échantillon est bien absorbé. Versez ensuite les billes contaminées dans un bécher de collecte marqué contenant une solution d’eau de Javel à 10 %. Incubez la boîte retournée. Le test de plaque est couramment utilisé pour détecter et quantifier les bactériophages. Mettez en culture la bactérie indicatrice en phase exponentielle et conservez-la sur glace. Étiquetez ensuite deux tubes microcentrifugeurs stériles respectivement « phage » et « témoin », puis ajoutez 50 microlitres d’échantillon de phage ou de tampon dans chacun. Tournez ensuite doucement la culture bactérienne dans le flacon, puis transférez un aliquot de bactéries dans un tube stérile, vortexez délicatement la bactérie indicatrice, puis ajoutez 500 microlitres de bactéries dans chaque tube d’absorption. Mélangez en secouant doucement les tubes. N’utilisez jamais le vortex ni une pipette vigoureuse pour les échantillons de phage. Incubez le mélange bactéries-phage à une température adaptée à la souche indicatrice pendant 20 minutes. Pendant ce temps, transférez deux tubes de gélose molle d’un bain-marie à 55 degrés Celsius vers un bloc chauffant à 48 degrés Celsius. Laissez équilibrer pendant 10 minutes. Étiquetez deux boîtes de gélose nutritive solide exemptes de condensation, préalablement équilibrées à température ambiante. Retirez un tube de gélose molle du bloc chauffant et vérifiez que son contenu n’est pas trop chaud au toucher. Transférez ensuite de manière aseptique le mélange du tube d’absorption de phage vers le tube de gélose molle. Tournez rapidement le tube entre les paumes pour mélanger le contenu. Avec le tube dans une main, ouvrez le couvercle de la boîte de gélose solide de l’autre main. Versez immédiatement tout le contenu du tube sur la surface de la boîte de gélose solide. Balancez doucement et rapidement la boîte. Fermez le couvercle et placez la boîte à l’horizontale pendant 30 minutes jusqu’à ce que la gélose molle durcisse. Répétez ensuite la procédure pour le tube d’absorption témoin en transférant le mélange témoin dans un tube de gélose molle. Mélangez, versez le contenu sur une boîte de gélose solide, balancez-la, puis laissez la gélose molle durcir pendant 30 minutes. Examinez les boîtes pour observer la formation de plaques. Pour isoler une plaque à partir d’un mélange hétérogène, percez soigneusement le centre avec un cure-dent stérile et transférez l’inoculum dans un tube microcentrifuge stérile contenant 100 microlitres de tampon de phage. Continuez à purifier ce lysat en répétant le test de plaque trois à six fois avec des dilutions sérielles si nécessaire. La technique de transfert sur empreinte exploite un phénotype sélectionnable en permettant la comparaison de la croissance cellulaire sur une boîte primaire avec celle sur des boîtes secondaires. Tracez une grille sur le fond de la boîte, étiquetez la boîte primaire et numérotez les carrés obtenus. Utilisez ensuite une technique aseptique pour retirer un cure-dent pré-stérilisé du bécher, touchez le centre de chaque carré avec un échantillon de cellules, puis jetez le cure-dent dans un récipient approprié pour les déchets. Incubez la boîte primaire. Empilez la boîte primaire et toutes les boîtes secondaires. Placez une marque d’orientation sur le côté de la moitié inférieure des boîtes. Retirez ensuite un morceau de velours stérile de son emballage et placez-le sur le bloc cylindrique. Placez ensuite le support en alignant les marques du support avec celles du bloc. Notez la marque d’orientation sur le bloc et le support. Retirez ensuite le couvercle de la boîte primaire. Alignez les marques d’orientation de la boîte et du bloc. Abaissez la boîte de manière à ce que la surface de la gélose entre en contact avec le tissu de velours. À l’aide des doigts, appuyez légèrement et uniformément sur le dos de la boîte primaire, puis soulevez-la délicatement du bloc. Vérifiez que l’empreinte des cellules est visible sur le velours. Remettez le couvercle sur la boîte. Répétez ensuite séquentiellement le protocole sur le tissu de velours avec chacune des boîtes secondaires. Utilisez l’empreinte de cellules provenant de la boîte primaire pour ensemencer jusqu’à huit boîtes secondaires, classées de la plus défavorable à la plus favorable en substrat. Enfin, comme contrôle positif, utilisez pour la dernière boîte de la série un milieu gélosé dans lequel toutes les souches testées doivent pouvoir croître. Fixez les boîtes retournées ensemble avec du ruban adhésif et incubez-les. Examinez les boîtes secondaires pour observer la croissance. Éteignez le bec Bunsen, puis rangez tous les équipements. Placez les vêtements de laboratoire contaminés, la verrerie et les déchets dangereux dans le récipient d’élimination approprié. Nettoyez la zone de travail avec un désinfectant. Lavez enfin soigneusement les mains avec un savon antiseptique et de l’eau tiède. Serratia marcescens est une protéobactérie gram négative en forme de bâtonnet qui produit un pigment rougeâtre appelé prodigiosine. Elle est couramment observée dans les salles de bains et sur les rideaux de douche. Dans cet exemple, la technique de stérilisation en croix produit des colonies isolées dans le quatrième quadrant. Cette analyse des bactéries présentes dans un échantillon d’eau prélevé à une fontaine publique utilise la méthode de la boîte versée. Remarquez la différence d’apparence des colonies. Les colonies superficielles sont grandes et de forme circulaire, tandis que certaines colonies superficielles sont très petites et de forme irrégulière. La méthode de l’ensemencement en surface est un élément clé des expériences d’enrichissement, de sélection et de criblage. Par exemple, la méthode copacabana est un outil différentiant dans le test classique de sélection bleu-blanc en technologie de l’ADN recombinant. Le phage T4 est un phage à ADN double brin virulent qui infecte son hôte Escherichia coli, entraînant la lyse de la cellule et la libération de phages descendants. Ce test de plaque sur gélose EHA montre des phages dans des zones de clairsemé d’environ un millimètre de diamètre. En l’absence de particules de phage infectieux, la croissance bactérienne produit une suspension trouble de cellules dans la gélose molle, où des colonies distinctes ne sont pas visibles. Dans la technique de la couche de gélose molle, les morphologies des plaques varient effectivement. Par exemple, ici, la même souche hôte de mycobactérie produit des morphologies de plaques distinctes en présence de phages destructeurs de microbactéries par rapport aux phages mycobactériens MSSS. La puissance du transfert sur empreinte réside dans le criblage simultané d’un grand nombre de microorganismes. Dans ce cas, quatre souches de pseudomonas ont été testées en double pour leur croissance sur trois sources de carbone différentes : l’acétamide, le lactose et la glycine. Ici, la boîte primaire est un milieu YTA complet ensemencé avec les quatre souches comme indiqué. Les souches montrent des profils de croissance variables sur les boîtes secondaires de milieu minimal MSA enrichi d’une seule source de carbone : acétamide, lactose ou glycine. Toutes les souches croissent sur la dernière boîte de contrôle positif, confirmant que les cellules ont été transférées sur toutes les boîtes secondaires de cette série. La présentation sous forme de tableau de ces résultats de transfert sur empreinte illustre le criblage simultané des différentes souches sauvages pour leurs besoins caractéristiques en croissance.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment effectuer des techniques de mise en place sur boîte sans contaminer les milieux ou les cultures, ainsi que savoir choisir la méthode de mise en place appropriée pour toute tâche expérimentale en laboratoire. La maîtrise de ces techniques nécessite de la pratique. Toutefois, avec une formation adéquate, les procédures de mise en place décrites dans cette vidéo deviendront naturelles lors des manipulations au laboratoire.