Cartographie inhibitrice circuits neuronaux par balayage laser photostimulation

L'objectif général de cette procédure est d'étudier l'organisation fonctionnelle locale des circuits neuronaux inhibiteurs. La procédure commence par la préparation de tranches cérébrales vivantes issues du cortex somatosensoriel primaire de souris. L'étape suivante consiste à visualiser et enregistrer les types cellulaires inhibiteurs exprimant la GFP ciblés dans la tranche cérébrale.

Après cette stimulation photo-induite par balayage laser à l’aide de glutamate, le piégeage temporaire (uncaging) est utilisé pour activer de petits groupes de neurones pré-synaptiques, soit de manière excitatrice, soit inhibitrice. Les courants post-synaptiques sont enregistrés dans les interneurones exprimant la GFP. La dernière étape consiste à effectuer la stimulation photo-induite, analyser les données et générer des cartes quantitatives des entrées synaptiques vers les neurones enregistrés.

En fin de compte, la stimulation photoélectrique par balayage laser combinée à des enregistrements en cellule entière permet de construire des cartes détaillées des entrées synaptiques vers des types spécifiques de neurones inhibiteurs, ce qui pourrait permettre de déterminer l'organisation et la fonction des circuits corticaux inhibiteurs locaux. La technique basée sur la photo-stimulation a été mise au point par le Dr. Larry Katz, Ned Calloway, puis davantage développée par le Dr. Carols Waboda, mon directeur de recherche, le Dr. Xing Z ayant été formé auprès du Dr. Calloway, à l'Institut Salk, où il a dirigé de nombreuses études sur les circuits interoraux. Notre équipe étend actuellement ces recherches et continue d'étudier les circuits interoraux.

Pour commencer cette procédure, sacrifier une souris transgénique âgée de deux à trois semaines après la naissance par découpage cervical et retirer rapidement le cerveau, puis placer le cerveau dans une solution de coupe froide et oxygénée. Ensuite, utiliser les lunettes GFP pour examiner visuellement le cerveau et vérifier l'expression de la GFP. Puis, découper le cortex somatosensoriel primaire en tranches de 400 micromètres d'épaisseur à l'aide d'un vibrosome.

Incuber les tranches dans du LCR A contenant du saccharose, saturé avec 95 % O₂ et 5 % CO₂, à 32 degrés Celsius pendant 30 minutes à une heure. Ensuite, transférer les tranches dans du LCR A ordinaire à température ambiante pour préparer le laser en vue de l'expérience : allumer le système de refroidissement du laser et son alimentation électrique. Puis, activer tous les composants matériels liés au contrôle de la photo-stimulation, notamment le système de miroir balayeur, le modulateur optique, l'obturateur électronique et l'amplificateur d'entrée du photodétecteur.

Ensuite, allumez l'équipement électrophysiologique, tel que l'amplificateur Multi Clamp 700 B et les micromanipulateurs. Les enregistrements électrophysiologiques, la photo-stimulation et l'imagerie sont réalisés dans la chambre de perfusion de tranches, montée sur la platine motorisée du microscope. Après cela, allumez la caméra d'imagerie ; la tranche sera visualisée au microscope droit équipé d'optiques DIC infrarouge et épifluorescentes via le système d'imagerie.

Ensuite, ouvrez le logiciel FS basé sur MATLAB et le logiciel de caméra Q Capture sur le moniteur. Avant d'exécuter l'expérience, vérifiez le système de stimulation lumineuse laser et assurez-vous qu'il est en état de fonctionnement. Placez une feuille de papier sous l'objectif de microscope à 4 x pour observer le motif de balayage laser pendant le fonctionnement du système.

Pour fabriquer l'électrode microscopique ayant une résistance de quatre à six mégohms, tirez une électrode en verre à l’aide d’un tireur de micropipettes. Ensuite, remplissez l’électrode avec une solution interne contenant 0,1 % de biotine pour le marquage cellulaire et l’identification morphologique. Puis, allumez le système de perfusion sous pression afin d’acheminer du LCR dans la chambre.

Veillez à maintenir un niveau constant de fluide à 2,0 millimètres au-dessus de la tranche dans la chambre. Un aliquot de la solution mère de glutamate piégé MNI est ajouté à 25 millilitres de LCR circulant pour obtenir une concentration de 0,2 millimolaire de glutamate piégé. Ensuite, transférez une tranche cérébrale dans la chambre d'enregistrement.

Exécutez le système d'imagerie pour vérifier la qualité de la coupe et localiser anatomiquement la région somesthésique primaire. Ensuite, fixez la coupe à l'aide d'un anneau en platine filaire sur mesure, en prenant soin de ne pas placer l'anneau au-dessus de la région cérébrale destinée à l'enregistrement. Visualisez les cellules à l'aide d'un objectif 60 x en vous appuyant sur la visualisation de l'expression de la GFP sous un microscope fluorescent DIC.

Identifier et sélectionner les types de cellules inhibitrices. Veuillez noter que l'enregistrement sera effectué sous contrôle visuel assisté par microscopie infrarouge à contraste interférentiel différentiel (DIC). Une surveillance vidéo et des basculements entre les modes DIC et fluorescence sont nécessaires pour confirmer l'emplacement de la cellule GFP tout en abaissant l'électrode vers la cellule cible.

En utilisant la technique classique de patch clamp. Appliquez d'abord une pression positive sur l'électrode. Rapprochez-la de la surface cellulaire afin de former un affaissement visible sur la membrane de la cellule ciblée.

Appliquez ensuite rapidement une pression négative pour former un scellement giga et pénétrer dans la cellule tout en surveillant les réponses aux injections de courant sur l'écran vidéo. Une fois la rupture effectuée, prenez des images du neurone interne exprimant la GFP enregistré en mode DIC et en mode fluorescent avec un grossissement de 60 x pour la vérification en temps réel. Avant de recueillir les données de stimulation lumineuse, injectez des impulsions de courant hyperpolarisantes et dépolarisantes afin d'examiner les propriétés électrophysiologiques de base de chaque cellule.

Une fois l'enregistrement en cellule entière stabilisé, avec une résistance d'accès satisfaisante, généralement inférieure à 20 mégohms, passez de l'objectif de microscope à 60 x à un objectif de 4 x pour la stimulation photoélectrique par balayage laser, acquérez une image de la tranche à 4 x et utilisez-la pour guider et enregistrer les sites de stimulation photoélectrique. Réglez les paramètres de stimulation photoélectrique et d'acquisition des données en activant le module de commutation de configuration de phys. Utilisez une impulsion laser d'une milliseconde d'une puissance d'environ 20 milliwatts et d'un intervalle de stimulation d'une seconde.

Pour la cartographie par stimulation photoélectrique, acquérez des tracés de données d'une seconde échantillonnés à 10 kilohertz. Ensuite, chargez l'image en coupe x dans le module de cartographie de phys. Définissez l'emplacement du soma et configurez les sites de stimulation photoélectrique selon un motif 16 × 16 avec une résolution de 80 micromètres par 80 micromètres.

Espace autour de l'emplacement de la cellule, couvrant toutes les couches corticales. Ensuite, cartographiez le profil d'excitation du neurone enregistré en examinant les emplacements de décharge en réponse à une stimulation photoélectrique en mode courant contrôlé. Notre logiciel convivial, doté de fonctions d'affichage en ligne, facilite les expériences de cartographie.

Ensuite, cartographier les connexions du circuit excitateu­r local en détectant les courants post-synaptiques excitateurs à partir de la cellule enregistrée. En utilisant un balayage laser à différents emplacements, maintenir la cellule à moins 70 millivolts en mode de blocage de tension afin de détecter les courants excitateurs entrants. Répéter ensuite les cartes des courants post-synaptiques excitateurs deux à trois fois en faisant pivoter ou en inversant le motif de photo-stimulation. Pour cartographier les connexions du circuit inhibiteur local, détecter les courants post-synaptiques inhibiteurs à partir de la cellule enregistrée.

Fixez la cellule à une valeur proche de zéro millivolt dans ce cas, à moins 15 millivolts en mode de blocage de tension afin de détecter les courants inhibiteurs sortants. Après avoir terminé tous les tests physiologiques, retirez délicatement l'électrode de la cellule enregistrée. Retirez la tranche cérébrale de la chambre, puis fixez-la dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant la nuit, et colorez les cellules enregistrées à l'aide de biotine.

Dans cette expérience, la combinaison de l'expression de la GFP, de l'électrophysiologie intrinsèque et des caractéristiques morphologiques est utilisée pour classifier les neurones inhibiteurs. Voici un exemple et une carte de données brutes illustrant la photo-stimulation par balayage laser, qui permet une cartographie détaillée des connexions locales du circuit cortical vers le neurone inhibiteur enregistré. Voici des exemples de cartes d'entrée quantitatives codées en couleur, dérivées des tracés bruts précédemment montrés dans la Figure D. Les amplitudes des événements synaptiques détectés dans le neurone intermédiaire enregistré sont codées en couleur et superposées de façon topographique aux emplacements de la photo-stimulation.

L'emplacement du corps cellulaire est indiqué par le cercle rouge ouvert dans l'échelle. Les couleurs chaudes indiquent des entrées synaptiques fortes, tandis que les couleurs froides indiquent une connectivité faible ou nulle avec la cellule ciblée. De même, la figure E présente le nombre d'événements synaptiques par site d'activation photochimique échantillonné pour le neurone enregistré.

La figure F illustre le délai d'apparition du premier événement synaptique détecté vers la cellule enregistrée après la photo-stimulation, indiqué par l'échelle. Les couleurs chaudes indiquent une courte latence d'entrée, tandis que les couleurs plus froides indiquent des latences synaptiques plus longues. Ainsi, la technique LSPS permet de construire des cartes détaillées de la position, de l'intensité, de la latence et du nombre d'entrées qui atteignent des types spécifiques de neurones inhibiteurs.

Eh bien, lors de cette procédure, il est important d'être patient, de préparer soigneusement les conditions expérimentales et de manipuler les neurones de manière efficace et très prudente lors du passage de l'objectif à fort grossissement à celui à faible grossissement. Ensuite, utilisez enfin le logiciel d'analyse correctement.