Approche non-Laser Microscopie Capture pour la microdissection des régions discrètes du cerveau de souris pour l'ARN isolement total et en aval séquençage de nouvelle génération et de profil d'expression génique

L'objectif général de cette procédure est de recueillir de l'ARN total à partir de noyaux cérébraux discrets de manière reproductible, cohérente, rentable et sans contamination par des ARNases. Cela est réalisé en préparant d'abord un environnement de travail exempt d'ARNases et en retirant l'ensemble du cerveau d'une souris décapitée. Ensuite, un coupe-tissu motorisé équipé d'un micromètre est utilisé pour découper des sections tissulaires sérielles de taille uniforme.

Ensuite, les régions cérébrales d'intérêt sont micro-disséquées à l'aide d'un carottier tissulaire de diamètre défini, tout en maintenant le tissu dans un environnement exempt d'ARN. Enfin, l'ARN total est isolé des noyaux cérébraux prélevés. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant un rendement et une qualité d'ARN total suffisants pour la préparation de bibliothèques d'ADNc en aval et le profilage du transcriptome par des essais spectrophoto­métriques ou fluorométriques.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'excision de régions cérébrales assistée par microscopie à capture laser ou par anatomie macroscopique, réside dans la possibilité de prélever plusieurs régions cérébrales discrètes d'intérêt à partir du cerveau d'un seul souris, de manière reproductible et économiquement suffisante. Cette méthode peut contribuer à répondre à des questions essentielles dans le domaine des neurosciences, notamment à savoir si des profils d'expression transcriptomique distincts au sein de régions cérébrales associées à des circuits neuronaux particuliers peuvent être corrélés à certains traits comportementaux, réponses environnementales ou états pathologiques. Pour préparer la microdissection, ajoutez à 100 millilitres de solution saline équilibrée d'Earl ou EBSS 0,44 gramme de bicarbonate de sodium et 0,884 gramme de glucose.

Traitez le EBSS avec 0,1 millilitre de DEPC dans un flacon ou une bouteille stérilisable par autoclave et à bouchon vissé pendant au moins 12 heures. À 37 degrés Celsius. Placez des pipettes en verre de cinq pouces et trois quarts dans un bécher en verre d'un litre et insérez des pinceaux d'artiste avec les poils orientés vers le haut dans un cylindre gradué en verre de 100 millilitres.

Ajouter suffisamment de solution d’eau traitée au DEPC pour recouvrir les pipettes et les brosses. Couvrir le bécher et le cylindre gradué avec du papier d’aluminium et incuber au moins 12 heures à 37 degrés Celsius. Après l’incubation de 12 heures avec le DEPC, chauffer tous les matériaux traités au DEPC à une température supérieure à 100 degrés Celsius pendant au moins 15 minutes. Refroidir. Le EBSS à température ambiante avant le stockage à quatre degrés Celsius.

Versez l’eau DD H2O hors du bécher et du cylindre gradué, puis poursuivez l’incubation à plus de 100 degrés Celsius jusqu’à ce que les matériaux soient secs. Retirez-les de l’incubateur, laissez-les refroidir à température ambiante et conservez-les pour une utilisation ultérieure. Le jour de l’expérience, traitez toutes les surfaces de travail pour éliminer toute contamination par les ARN, et placez le EBSS dans un bain-marie réglé à 40 degrés Celsius pour le tamponner et l’oxygéner.

Imprégnez le EBSS avec 5 % de CO2 et 95 % d'oxygène en plaçant un tube à gaz dans une pipette Pasteur exempte d'ARN, puis insérez la pipette dans le EBSS en recouvrant l'ouverture du récipient contenant le EBSS. Installez un coupe-tissus pour la sectionnement en série du tissu cérébral.

Traitez les surfaces supérieure et inférieure du coupe-tissus. Pour éliminer la contamination par les ARN, fixez un morceau rectangulaire de papier filtre Watman numéro quatre sur la surface en plexiglas du hachoir à tissus. Fixez une lame de rasoir double tranchant au bras du hachoir.

Régler le micromètre sur zéro et ajuster la hauteur minimale du bras du coupeur afin que la lame de rasoir découpe le papier filtre, mais pas la plaque de plexiglas. Rassembler tous les matériaux supplémentaires nécessaires à la microdissection, notamment des boîtes de culture cellulaire de 60 par 15 millimètres sans ARN, des embouts de micropipette courbés de 200 microlitres sans ARN, des ciseaux courbes, de la glace sèche et des tubes pour la collecte des tissus. Placer les tubes sur de la glace sèche après avoir décapité une souris à l’aide d’une guillotine pour rongeurs et retiré l’ensemble du cerveau, y compris le cerveau postérieur et les nerfs optiques, intacts.

Placer le cerveau dans la partie supérieure d'une boîte de culture cellulaire sans ARNase de 60 par 15 millimètres. Ensuite, le transférer vers la surface de travail pour l'échantillonnage tissulaire. Utiliser une pipette sans ARNase pour humidifier modérément le papier filtre fixé au hacheur tissulaire avec du EBSS.

Humidifiez le tissu cérébral avec du EBSS. Transférez le cerveau sur le coupe-tissus et positionnez-le de manière à ce que la surface ventrale repose sur le papier filtre. La ligne médiane doit être perpendiculaire à la lame du coupe-tissus, et le bord rostral du cerveau doit être en contact avec la lame.

Utilisez un pinceau d'artiste traité avec du A-D-E-P-C pour maintenir le cerveau immobile en exerçant une pression douce sur la surface dorsale du cerveau tout en le maintenant fixe. Soulevez le levier du porte-lame d'environ quatre à cinq centimètres au-dessus de la surface tissulaire dorsale et maintenez-le dans cette position. Retirez le pinceau de la surface du cerveau et réglez sur 750 micromètres.

Utilisation du micromètre. Laisser le levier tomber pour découper le tissu et obtenir une section coronaire de 750 micromètres, la lame du hachoir restant immobile. Utiliser un mouvement de roulement avec le pinceau d'artiste pour déplacer délicatement la section de tissu loin de la surface de la lame.

Placer immédiatement la coupe tissulaire dans le EBSS oxygéné contenu dans la boîte de Pétri. Cette tranche est désormais prête pour la microdissection. Répéter la procédure de découpage jusqu'à l'obtention de coupes cérébrales en série sur tout le plan rostro-caudal afin d'effectuer la microdissection.

Tout d'abord, vérifiez l'éclairage afin de vous assurer que l'illumination de l'échantillon ne sera pas obstruée. Ajustez la position et le débit du mélange O2 CO2 pour maintenir un environnement oxygéné tamponné pour le tissu. Pendant la procédure, identifiez la coupe cérébrale coronale incluant la région d'intérêt et, à l'aide d'un pinceau d'artiste, positionnez-la à plat sur le fond de la boîte de Pétri.

Sélectionnez le noyau de tissu ayant le diamètre approprié. Maintenez fermement la section tissulaire coronale en place à l’aide du pinceau d’artiste, puis abaissez l’embout de prélèvement cylindrique sur la surface de la section tissulaire. En exerçant une pression, enfoncez l’embout à travers la section tissulaire jusqu’à ce qu’il s’appuie fermement contre le fond de la boîte de Pétri.

Utilisez un mouvement circulaire de roulement afin de garantir que la région d’intérêt a été dissociée du tissu environnant. Soulevez délicatement le noyau tissulaire de la section de tissu et libérez le micro-punch, en lui permettant de flotter dans l’EBSS à l’aide d’un pinceau de peintre. Déposez immédiatement le micro-punch tissulaire dans un tube de stockage stable à −80 °C placé sur de la glace sèche.

Le tissu doit adhérer facilement à la paroi du tube. Remettez le tube contenant l'échantillon de microdissection dans la glace sèche. Répétez cette microdissection pour chaque région cérébrale d'intérêt.

Une fois la microdissection terminée, enregistrez les étiquettes ou codes-barres respectifs de chaque tube contenant un échantillon. Placez les échantillons de tissu dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius jusqu'à l'extraction de l'ARN afin d'extraire l'ARN des échantillons de tissu. Préparez d'abord un espace de travail exempt d'ARN.

Préparez une quantité suffisante de mélange de billes magnétiques et de solution de lyse-fixation conformément aux instructions du manuel du kit d'isolement d'ARN total. Retirez les échantillons de tissu du congélateur à moins 80 degrés Celsius et placez directement les tubes sur de la glace sèche. Ajoutez 100 microlitres de la solution de lyse-fixation à un tube d'échantillon.

Attacher un pilon de taille 0,5 millilitre en tube sans nucléase à l’agitateur à pastille et homogénéiser le tissu à l’aide d’une pointe de pipette sans nucléase à faible rétention. Transférer immédiatement l’échantillon homogénéisé dans un puits d’une plaque de culture tissulaire 96 puits à fond rond en utilisant le même type de pointe. Ajouter 60 microlitres d’isopropanol à 100 % à l’échantillon.

Ajoutez 20 microlitres du mélange de billes à l'échantillon et mélangez en pipetant de haut en bas trois à quatre fois. Suivez les étapes du protocole du kit d'isolement d'ARN total pour terminer l'extraction d'ARN total. Enfin, mesurez la pureté et la concentration de l'ARN total obtenu. Les données d'ARN total provenant de micro-prélèvements de différentes régions cérébrales sont présentées dans ce tableau.

Les échantillons d'ARN dilués avec 30 microlitres de tampon d'élution ont fourni suffisamment d'ARN total pour être utilisés avec des produits commerciaux de préparation d'ADNc destinés aux applications de séquençage de l'ARN. De plus, le rendement en ARN et les rapports 260 à 280 sont des valeurs uniques obtenues à partir d'échantillons respectifs de microdissection, afin de montrer les mesures obtenues pour chaque région cérébrale, et ils confirment la haute pureté des échantillons. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en huit à dix minutes si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de minimiser le risque de contamination par l'ARN des surfaces de travail ou des échantillons de tissus en n'utilisant que des matériaux sans ARN ou traités contre l'ARN.