Isolement et caractérisation de Hoechst ^Faible CD45 ^Négatifs Souris Cellules souches mésenchymateuses du poumon

Ce vidéo montre un protocole pour l'isolement de cellules souches mésenchymateuses pulmonaires négatives pour le CD45 faible de l'hôte. Les cellules souches mésenchymateuses, ou MSC, sont des régulateurs importants de la réparation ou de la régénération tissulaire, de la fibrose, de l'inflammation et de l'angiogenèse. Premièrement, les poumons sont disséqués à partir d'une souris sacrifiée.

Le tissu pulmonaire est digéré afin d'obtenir une suspension monocellulaire. Les cellules sont marquées au colorant hoax et à l'anticorps anti-CD45, puis triées par cytométrie en flux pour obtenir les CSM pulmonaires CD45 négatives et faiblement exprimées chez l'hôte. Les CSM pulmonaires sont ensuite mises en culture pour expansion, et un test de formation de colonies est réalisé afin d'évaluer leurs capacités de différenciation.

Des études supplémentaires peuvent ensuite être menées afin d'examiner le rôle des cellules souches mésenchymateuses lors de l'homéostasie tissulaire et des maladies. La méthode que nous présentons ici permet d'isoler des cellules souches mésenchymateuses pulmonaires de souris ou humaines, et peut être appliquée à l'étude de maladies pulmonaires telles que la fibrose pulmonaire, l'hypertension pulmonaire et la BPCO. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés en raison de la variété des méthodes disponibles pour la préparation des tissus, ainsi que pour la configuration du cytomètre en flux, les contrôles appropriés et l'analyse.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car il est difficile de décrire par des mots la technique appropriée pour hacher et digérer le tissu pulmonaire afin d'obtenir une viabilité optimale des cellules. De plus, la configuration de l'appareil de cytométrie en flux et les analyses sont mieux transmises par une démonstration. Commencez ce protocole en retirant les poumons qui seront utilisés pour obtenir des cellules souches mésenchymateuses d'une souris adulte sacrifiée.

Utilisez une petite paire de ciseaux pointus pour couper latéralement la cage thoracique de chaque côté de la souris. Ouvrez la cavité thoracique, puis retirez le diaphragme. Insérez une seringue de 10 millilitres équipée d'une aiguille de calibre 20 et demi dans le ventricule droit du cœur et appuyez doucement sur le piston pour perfuser trois à cinq millilitres de PBS, éliminant ainsi le sang des poumons.

Ensuite, à l’aide de ciseaux, sectionez la trachée et les gros bronches, puis jetez-les. Puis, à l’aide de pinces, saisissez les petits lobes pulmonaires blancs et placez-les dans une boîte de Pétri remplie de solution saline tamponnée au Hank ou HBSS.

Ensuite, retirez le cœur et séparez les lobes pulmonaires. Répétez ce processus pour toutes les souris de l'étude. Transférez les lobes pulmonaires sur le couvercle de la boîte.

Humidifiez le tissu avec juste assez de HBSS pour éviter qu’il ne s’assèche. Ensuite, à l’aide d’un scalpel jetable, hachez les lobes pulmonaires afin d’obtenir de la moelle osseuse à utiliser comme contrôle de maintien pour la cytométrie en flux. Utilisez une paire de ciseaux pointus pour couper au niveau de la cheville et de l’extrémité supérieure du fémur.

Placer le membre dans une nouvelle boîte de Pétri. Ensuite, couper le genou, en laissant un segment linéaire de fémur et un deuxième segment contenant le tibia et la fibula. À l’aide de pinces, retirer le muscle pour mettre à nu le tibia, la fibula et le fémur.

Prenez maintenant une seringue de cinq millilitres munie d'une aiguille de calibre 26 et demie et insérez l'aiguille dans l'orifice de la moelle osseuse. À une extrémité du tibia, tenez l'os avec l'autre extrémité dirigée vers un tube conique de 50 millilitres contenant 15 millilitres de HBSS, puis appuyez sur le piston pour délivrer le HBSS et rincer la moelle osseuse dans le tube. Répétez ce processus avec une fibula et un fémur.

Colorer la moelle osseuse avec l'hôte 3 3 3 4 2 à une concentration finale de cinq microgrammes par millilitre dans du DMEM à haut glucose supplémenté. Ensuite, une suspension monocellulaire de tissu pulmonaire sera préparée à partir du tissu isolé. Placer chaque poumon dans un tube contenant du Worthington 0,2 % préchauffé.

Préparez la collagénase de type II dans du HBSS stérile, puis immergez le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius et incubez pendant 30 minutes. Après l'incubation, utilisez la pipette de 10 millilitres pour triturer l'échantillon jusqu'à ce que le digest s'écoule facilement à travers la pipette. Effectuez environ 10 répétitions, puis incubez pendant 15 minutes supplémentaires à 37 degrés Celsius pour terminer la digestion tissulaire.

Une fois la digestion terminée, diluez la suspension cellulaire avec du HBSS et utilisez une pipette de cinq millilitres pour tenter à nouveau de disperser les fragments tissulaires résiduels. Ensuite, afin d'éliminer les fragments tissulaires non digérés, versez la suspension à travers un tamis cellulaire de 70 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres. Ajoutez la suspension petit à petit pour permettre à l'échantillon de traverser le tamis cellulaire.

Si des fragments de tissu non digérés bloquent complètement l'écoulement de la suspension cellulaire, versez-la à travers un nouveau filtre à cellules dans un nouveau tube. Faites centrifuger la suspension cellulaire pendant 10 minutes à 450 RCF.

Après la centrifugation, décanter le surnageant et redisperser délicatement le culot cellulaire dans du tampon d'hémolyse à température ambiante. Incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Puis ajouter un volume équivalent de HBSS pour inactiver le tampon d'hémolyse.

Verser la suspension cellulaire dans un filtre cellulaire de 40 micromètres afin d'éliminer les débris et les agrégats cellulaires, en récupérant le filtrat dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Ensuite, à l’aide d’un hémocytomètre, déterminer le nombre de cellules pour les échantillons de poumon et de moelle osseuse. Noter la concentration et le volume total de la suspension cellulaire.

Ensuite, faire un culot de la suspension de cellules pulmonaires uniques par centrifugation à 450 RCF pendant 10 minutes. Pour maintenir les cellules, resuspendre simultanément les cellules pulmonaires et celles de la moelle osseuse à raison de 10 puissance six cellules par millilitre dans un DMEM à haute teneur en glucose, supplémenté et préchauffé.

Pour colorer l'ADN, ajoutez le colorant HOAXED 33342 à une concentration finale de cinq microgrammes par litre. Ensuite, mélangez les cellules par retournement doux et incubez-les dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant exactement 90 minutes. Puis centrifugez pendant 10 minutes à 450 G à quatre degrés Celsius après la rotation.

Procéder à la coloration des tissus pulmonaires et de la moelle osseuse avec l'anticorps anti-CD45 et l'iodure de propidium en vue de leur analyse par cytométrie en flux. Une fois les cellules colorées, conserver les tubes sur de la glace, à l'abri de la lumière, jusqu'à l'analyse par cytométrie en flux. Préparer la cytométrie en flux en s'assurant que les lasers de l'appareil sont alignés et qu'il est configuré pour le tri cellulaire.

L'appareil utilisé doit être équipé de lasers bleu à 488 nanomètres, rouge à 635 nanomètres et UV entre 350 et 355 nanomètres, ainsi que de deux détecteurs sur le trajet du laser UV, munis de filtres bleu 45/65 et rouge 675/50. En outre, le détecteur UV-rouge doit présenter une sensibilité élevée pour le signal rouge, et l'appareil doit être équipé d'un système de refroidissement permettant de maintenir l'échantillon à 10 degrés Celsius. Dans le logiciel de l'appareil, configurez des histogrammes pour afficher la diffusion avant linéaire en fonction de la diffusion latérale, ainsi qu'un graphique de discrimination des doublets adapté à l'appareil.

Un tracé d'histogramme de l'iodure de propidium (PI) utilisant un signal logarithmique, un nuage de points rouge contre bleu utilisant des signaux linéaires et un tracé d'histogramme de CD45-APC utilisant un signal logarithmique. Une fois que l'appareil est prêt, placer l'échantillon de moelle osseuse marqué dans le port de chargement de l'appareil. Cet échantillon sert de témoin de marquage et de réglage de l'appareil.

Commencez à collecter les événements et ajustez les signaux linéaires de diffusion avant. Pour visualiser clairement la population cellulaire, les cellules doivent se situer approximativement au centre inférieur du graphique, la diffusion avant étant en abscisse. Étant donné que la coloration nucléaire PI est perméante à la membrane IMP, elle sera exclue des cellules vivantes.

Dessinez une région de sélection sur les cellules mortes positives au PI dans l'histogramme du PI. Indiquez au logiciel de l'appareil de colorer les cellules mortes. Dans cette région, en rouge.

Il est utile d'utiliser la coloration des cellules mortes perméabilisées comme guide pour identifier la population hôte G0 G1. La coloration par l'iodure de propidium est également excitée par le laser UV, et la majorité des cellules mortes doivent être en dehors de l'échelle. Sur le côté droit du graphique de fluorescence rouge contre bleue en fausse couleur, la population G0 G1 de la moelle osseuse doit apparaître comme un groupe compact d'événements sur le graphique rouge contre bleu en fausse couleur.

Régler les tensions du détecteur afin de positionner l'amas G0-G1 dans le coin supérieur droit du centre du tracé. Une partie de la phase S et l'ensemble de la phase G2 du cycle cellulaire peuvent être hors échelle. Sur le coin supérieur droit du tracé rouge contre bleu trafiqué, la population latérale faible sera visible en train de s'étirer depuis le côté gauche de l'amas G0-G1 jusqu'au coin inférieur gauche du tracé.

Tracez maintenant une porte autour de l'amas cellulaire dans le diagramme FSC par rapport à SSC. Représentez graphiquement la population de cellules simples identifiée sur le tracé des doublest et les cellules vivantes sur l'histogramme de PI. Ensuite, configurez le tracé hoax pour afficher uniquement ces populations sélectionnées.

Après avoir défini le tracé hôte, dessinez une région autour de la population latérale. Attribuez cette région comme une fenêtre au graphique CD 45 A PC, ainsi qu'aux fenêtres de diffusion latérale des cellules uniques et des cellules vivantes. Maintenant que le système est configuré, retirez l'échantillon du port de chargement et placez l'échantillon pulmonaire dans le port de chargement.

Les paramètres de l'instrument ne devraient pas avoir besoin d'être ajustés à nouveau pour cet échantillon. Commencez à collecter les événements sur le graphique rouge contre bleu. L'amas G zéro G un pour l'échantillon pulmonaire apparaît généralement plus allongé dans la direction de l'axe des x et ressemble au symbole tilde sur un clavier.

La porte de la population latérale doit être positionnée de manière similaire à celle réglée pour l'échantillon de moelle osseuse. De légers ajustements vers le haut ou vers le bas peuvent être nécessaires afin d'assurer une résolution nette de la population latérale. Maintenir une faible différence de pression pendant le tri en veillant à ce que la vanne d'écoulement de l'échantillon ne soit pas ouverte trop largement.

Ensuite, pour isoler les CSM, placez une plaque de collecte de 96 puits dans la chambre de tri et configurez les fenêtres de tri sur l'histogramme CD45 APC afin de séparer les populations positives et négatives. Enfin, récupérez les cellules soit comme une population mixte dans un tube, soit en cellules individuelles pour isoler des clones dans une plaque de 96 puits. Après le tri cellulaire des CSM pulmonaires, les cellules sont ensemencées dans des boîtes de 30 millimètres contenant du milieu AMEM supplémenté avec 20 % de SFB. Premièrement, les cellules triées apparaissent petites, rondes et brillantes après environ deux à trois semaines.

Des colonies présentant le phénotype mésenchymateux deviennent visibles et la prolifération est plus évidente pour chaque préparation cellulaire. Évaluer la capacité des CSM pulmonaires à se différencier en lignées mésenchymateuses classiques telles qu'ostéoblastes, adipocytes et chondrocytes, ainsi que leur expression membranaire de marqueurs mésenchymateux reconnus. Réaliser une analyse cytogénétique par banding afin de confirmer l'absence d'anomalies chromosomiques grossières.

Après l'isolement par cytométrie en flux et la génération de clones monocellulaires, un test de formation de colonies est réalisé pour caractériser les cellules MSC et leurs capacités de différenciation. Commencez avec des cellules diluées à trois fois 10 puissance quatre cellules par millilitre. Dans des boîtes de 100 millimètres contenant du milieu de culture incomplet, effectuez des dilutions en série de deux, six fois 10 puissance quatre, trois fois 10 puissance quatre, 1,5 fois 10 puissance quatre et 0,75 fois 10 puissance quatre cellules par boîte, dans 10 millilitres de milieu, en triplicata.

Ensuite, après 10 jours de culture, placer les plaques dans l'incubateur, éliminer le milieu et rincer les cellules avec du PBS. Puis les fixer en ajoutant du méthanol à 100 % pendant cinq minutes à température ambiante. Après cinq minutes, éliminer le méthanol.

Ensuite, pour détecter la formation de colonies, ajoutez de la gza à 0,4 % poids par volume, diluée au 1/20 avec de l'eau ionisée, et incubez de 10 à 15 minutes. Puis, éliminez le colorant par décantation et rincez à l'eau ionisée. Laissez sécher les échantillons à l'air libre et quantifiez le nombre de colonies contenant plus de 25 cellules par colonie à l'aide d'un microscope inversé ou d'une méthode de visualisation.

Les colonies sont grandes et composées de quelques centaines de cellules, comme illustré ici, et présentent un phénotype mésenchymateux. Les CSM ont été isolées comme montré dans cette vidéo et mises en culture dans des plaques de 96 puits en conditions de croissance simulée. Des cellules présentatrices d'antigène marquées au CFSE et arrêtées en phase de croissance ont ensuite été ajoutées aux CSM pulmonaires.

La prolifération des CSM isolées a ensuite été mesurée par la diminution de l'intensité moyenne de fluorescence du CFSE par rapport au fond, constitué de lymphocytes T marqués au CFSE seuls, comme illustré sur cette figure, en l'absence de SC pulmonaire et en présence de cellules présentatrices d'antigène, les APC, avec ou sans albumine OVA. Les lymphocytes T effecteurs CD40 positifs montrent une diminution de l'intensité de fluorescence du CFSE, ce qui indique une prolifération, entourée en rouge. L'intensité de fluorescence du CFSE au niveau de la membrane des lymphocytes T diminue de façon équitable à chaque division cellulaire, c'est-à-dire de moitié à chaque division. En présence de CSM pulmonaires, APC avec ou sans OVA, les lymphocytes T effecteurs CD40 positifs ne montrent aucun changement significatif de l'intensité du CFSE, ce qui indique une absence de prolifération après leur activation. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des cellules souches pulmonaires pour explorer le rôle des cellules souches mésenchymateuses dans des maladies pulmonaires telles que l'hypertension artérielle pulmonaire et la fibrose pulmonaire.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ cinq heures en suivant cette procédure. D'autres méthodes, telles que les tests de différenciation, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, notamment pour déterminer si les cellules souches mésenchymateuses pulmonaires présumées présentent une différenciation multipotente adéquate, notamment en os, en graisse et en cartilage.