Visualisation virus de la dengue grâce à Alexa Fluor Étiquetage

L'objectif général de cette expérience est de marquer le virus de la dengue avec un fluorochrome pour des études microscopiques. Préparez les tampons nécessaires et purifiez le virus de la dengue à l'aide d'un coussin de saccharose. Reconstituez le colorant Amy React Alexa Fluor et le virus de la dengue dans le tampon de marquage. Marquez le virus de la dengue avec une concentration de cent micromolaire d'Alexa Fluor.

Incuber pendant une heure et arrêter la réaction de marquage avec le réactif secondaire. Purifier le virus de la dengue marqué par chromatographie d'exclusion stérique. Retitrer le virus marqué par dosage des plaques et estimer le degré de marquage par dosage d'immunofluorescence.

Bonjour, je suis Sam Jang des DSO National Laboratories, travaillant dans le laboratoire du Dr. Wee dans le cadre du programme sur les maladies infectieuses émergentes après l'obtention de mon diplôme à l'école de médecine de l'Université nationale de Singapour. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment marquer de façon fluorescente le virus Denki à l'aide d'un colorant Alexa Fluor réactif à l'amine pour des études d'imagerie. Les colorants Alexa Fluor présentent une stabilité supérieure et sont moins sensibles au pH que les colorants courants tels que la fluorescéine et la rhodamine, ce qui les rend idéaux pour les études sur l'absorption cellulaire et le transport endosomal du virus.

L'étiquetage du virus de la dengue à l'aide d'Alexa Fluor facilitera la compréhension de la pathogenèse de la dengue. Commençons donc. Avant la réaction d'étiquetage, préparez un tampon d'étiquetage frais et le réactif d'arrêt selon le protocole écrit, puis purifiez le virus de la dengue par coussin de saccharose. Ajoutez un volume approprié du virus de la dengue purifié au tampon d'étiquetage dans un tube de microcentrifugeuse afin d'obtenir une concentration de 300 millions d'unités formant des particules par millilitre.

Cela peut être augmenté proportionnellement pour l'étiquetage par lots de virus. Reconstituez le colorant Alexa Fluor lyophilisé à une concentration d'un millimolaire dans le tampon d'étiquetage juste avant la réaction d'étiquetage.

Minimisez l'exposition à la lumière à partir de cette étape. À des fins de démonstration, le colorant Alexa floor restera non protégé de la lumière : ajoutez 800 microlitres du colorant Alexa flow à une concentration de un millimolaire au virus de la dengue dilué, tout en mélangeant doucement à l’aide de la pointe d’une micropipette.

Incuber pendant une heure à température ambiante, à l’abri de la lumière, en mélangeant par des inversions douces toutes les 15 minutes. Après une heure, centrifuger brièvement les tubes. Prélever 800 microlitres de la sous-région tout en agitant doucement avec la micropipette, puis incuber pendant une heure supplémentaire à température ambiante, à l’abri de la lumière, en effectuant des inversions douces toutes les 15 minutes.

Entre-temps, équilibrez la colonne de purification avec 25 millilitres de tampon HNE. Après l'incubation d'une heure, appliquez le virus marqué sur la colonne et commencez à recueillir l'écoulement. Remplissez la colonne avec du tampon HNE.

Une fois que tout le virus marqué est entré dans la matrice, jetez les premiers 2,5 millilitres de l'écoulement et recueillez les deux millilitres suivants de la fraction de virus marqué. Conservez le virus marqué purifié à moins 80 degrés Celsius. Déterminez le titre du virus marqué par un dosage par plaque.

Dans une expérience typique, on devrait observer une baisse inférieure à dix fois du titre viral. Après le marquage, un dosage par immunofluorescence doit être réalisé pour évaluer le degré de marquage. Pour ce faire, dénombrer les cellules virales à l’aide d’un hémocytomètre et ajouter le volume approprié de cellules au milieu de culture afin d’obtenir une densité de 50 000 cellules par millilitre.

Verser un millilitre de cellules virales par puits dans une plaque de quatre puits contenant un couvre-verre stérile. Incuber les cellules toute la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Retirer la plaque de l’incubateur et aspirer le surnageant des puits ; remplacer par les cellules avec environ un MOI du virus marqué dans un volume de cent microlitres pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius.

Retirer l'inoculum et laver les cellules avec 0,5 millilitre de tampon PBS par puits. Aspirer et répéter cette procédure deux fois supplémentaires. Fixer les cellules avec 200 microlitres de paraformaldéhyde à 3 % par puits pendant 30 minutes à température ambiante.

Lavez les cellules trois fois avec 0,5 millilitres de tampon PBS par puits. Fixez les cellules avec la solution de fixation à température ambiante pendant 30 minutes. Retirez le couvre-puits du puits à l’aide de pinces fines.

Éliminer le liquide excédentaire en appuyant légèrement sur le bord de la lame. Faire glisser contre une feuille blanche. Placer le côté cellulaire de la lame.

Incuber 25 microlitres d'anticorps contre la protéine E de la dengue sur un morceau de parafilm. Incuber pendant une heure dans une chambre humide à température ambiante, à l'abri de la lumière. Ensuite, transférer le coverslip dans une plaque à six puits et ajouter deux millilitres de tampon de lavage par puits.

Aspirez le surnageant. Répétez ces étapes de lavage deux fois supplémentaires après le dernier lavage. Retirez le coverslip du puits à l’aide de pinces fines.

Éliminer le liquide excédentaire en trempant le bord de la lame. Faire glisser contre un essuie-papier. Placer le côté cellulaire de la lame.

Incuber pendant 8 h avec 25 microlitres d'anticorps secondaire anti-souris conjugué à l'Alexa sur un lambeau de parfum. Incuber pendant 45 minutes dans une chambre humide à température ambiante, à l'abri de la lumière. Une fois l'incubation terminée, transférer la lamelle recouverte de cellules dans une plaque à six puits et laver les cellules trois fois avec deux millilitres de tampon de lavage pour chaque lavage. Après le dernier lavage, retirer la lamelle du puits et la rincer une fois dans de l'eau ionisée.

Éliminer le liquide excédentaire en apposant contre du papier. Déposer délicatement la lame couvre-objet sur une lame de microscope avec huit microlitres de solution de montage douce. Laisser la solution de montage durcir toute la nuit à l'air libre à quatre degrés Celsius.

L'échantillon est désormais prêt à être visualisé au microscope fluorescent ou confocal. Déposez une petite goutte d'huile à immersion sur la surface du coverslip et fixez-le sur le microscope. Placez la lame sur la platine du microscope.

Réglez la platine jusqu'à ce que l'objectif du microscope entre en contact avec l'huile à immersion. Pour une image claire, éteignez les lumières ambiantes à l'aide du logiciel Zes Zen. Cliquez sur le bouton oculaire pour observer directement l'échantillon à travers l'oculaire du microscope.

Trouvez un champ rempli de cellules et ajustez la mise au point. Passez maintenant en mode acquisition. Pour minimiser le couplage entre les canaux, sélectionnez des pistes distinctes pour Alexa Fluor 488 et Finite Four.

Utilisez des colorants et réglez les acquisitions pour une excitation et une détection séquentielles. Ajustez le gain et le décalage de la puissance du laser afin de garantir que l'image n'est ni surexposée ni sous-exposée. Acquérez l'image et analysez une zone d'intérêt à l'aide de la fonction de colocalisation.

Le coefficient de recouvrement peut être utilisé pour estimer le degré de marquage du virus de la dengue par le colorant Alexa Fluor. Un essai d'immunofluorescence simple a été réalisé sur des cellules virales et le degré de marquage peut être estimé à partir de la colocalisation du virus marqué avec une protéine E anti, le coefficient de recouvrement des colorations par anticorps variant de 0,65 à 0,8, suggérant qu'environ 65 à 80 % des particules ont été marquées avec le colorant Alexa Fluor. Pour que la procédure de marquage soit réussie, il est important de préparer le tampon de marquage fraîchement et de reconstituer le colorant Alexa Fluor juste avant le marquage.

La concentration de colorant à utiliser peut être davantage optimisée en fonction de vos besoins. Cette méthode d'étiquetage du virus de la dengue peut potentiellement être adaptée pour étiqueter d'autres virus. Voilà donc tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance pour votre expérience de marquage.