Capturez cellule à l'aide d'un dispositif microfluidique

Les dispositifs tels que nous les avons préparés sont conditionnés en kits de 10 ou 20 unités, et lorsqu’ils arrivent, ils sont expédiés au frais dans une boîte. Le kit contient tous les composants nécessaires à la réalisation de l’expérience. Le kit comprend un sachet contenant toutes les seringues et les tampons, qui peuvent rester à température ambiante. Il contient également une copie du protocole que nous allons suivre pour cette expérience.

Il existe également une boîte réfrigérée, qui contient les dispositifs eux-mêmes et tous les tampons de fonctionnement devant être conservés au froid. Généralement, les kits sont conditionnés par groupes de 10 ou 20. Lorsqu'ils ne sont pas utilisés, les kits doivent être réfrigérés.

Chaque seringue et chaque composant du kit est soigneusement étiqueté, et les étiquettes correspondent au tableau du protocole que nous suivons. Il n’y a donc aucune ambiguïté quant à la seringue ou au composant du kit à utiliser à chaque étape. Après avoir déballé les dispositifs et les avoir placés dans une cabine de sécurité biologique, nous effectuerons la procédure d’isolement des neutrophiles et leur lyse en vue d’applications génomiques ultérieures, car l’échantillon que nous obtenons sera utilisé pour l’isolement, ou plutôt, nous extrairons l’ARN du lysat cellulaire.

Pour cette raison, nous voulons nous assurer que notre espace de travail est propre, non seulement au sens stérile, mais aussi exempt de tout ARN présent habituellement dans l'environnement. Il est donc très important de nettoyer soigneusement toute la zone et les appareils avec une solution capable de détruire les ARN. Typiquement, nous nettoyons tous nos outils et surfaces de travail avec RNA SAP ou RNAs away, que l'on peut obtenir auprès de plusieurs fabricants.

L'appareil est fourni emballé dans un sachet scellé à chaud. Chaque appareil est scellé et identifié par un code-barres. Vous devez noter ce code-barres si vous travaillez avec des échantillons cliniques.

Ainsi, le dispositif est ouvert, le couvercle est retiré et il est placé dans le collecteur de pompe. L'échantillon de sang utilisé est un échantillon de sang total. Nous allons le faire circuler à travers une seringue BD standard de 1 ml, et celle-ci est désignée comme seringue un.

Typiquement, on retire la seringue de son emballage et on enlève soigneusement le bouchon du tube à sang. Ensuite, on dépose 700 microlitres ou 0,7 ml de sang, puis on injecte la moitié de ce volume, soit 350 microlitres, dans un tube de 1,5 ml. Ainsi, votre sang peut être transmis pour un traitement ultérieur.

Votre tube de sang peut être transmis, tout en conservant suffisamment de sang en réserve en cas de défaillance d'un dispositif. Nous allons donc charger la seringue contenant le sang sur cette aiguille, qui est reliée à un morceau de tubulure intégré à ce dispositif, précisément au dispositif d'isolement microfluidique.

Nous devons être très prudents afin de ne pas introduire de bulles d'air dans le dispositif, car cela pourrait entraîner un mauvais fonctionnement du dispositif. Typiquement, nous prenons la seringue, appuyons doucement sur le piston et ajoutons le liquide sur la surface supérieure du dispositif, en veillant à ce qu'il soit complètement imprégné avant d'avoir expulsé tout le liquide. Nous nous arrêtons, puis retirons soigneusement le corps de la seringue de l'aiguille, et remplissons essentiellement la pointe de l'aiguille ou bien le connecteur d'adaptation de l'aiguille avec le tampon restant contenu dans cette seringue.

Nous nous débarrassons de cela. Ensuite, nous allons prendre notre seringue contenant le sang et l'insérer dans cet embout à raccordement. Il faut faire attention à ne pas renverser le sang et à ne pas introduire de bulles d'air.

Il est préférable d'utiliser un kemo pour tenir le corps de la seringue et le tube au cas où du sang serait renversé. Une fois la seringue raccordée au logement du tube ou à l'aiguille, on donne quelques petits coups secs pour éliminer les bulles d'air éventuellement présentes au niveau du raccord. Cette seringue est ensuite chargée sur la pompe à seringue, puis fixée à l'aide de la vis de blocage.

La pompe à seringue est allumée et elle est déjà préréglée à nos conditions d'écoulement. Nous allons faire circuler ce sang à travers le dispositif à un débit de 30 microlitres par minute. Une fois que le corps de la seringue est chargé dans la pompe à seringue, nous allons appuyer sur le bouton du bras mobile du piston et le faire glisser vers le bas jusqu'à ce qu'il touche le haut du piston et commence à expulser le fluide par l'extrémité de celle-ci.

Il s'agit d'une aiguille en acier inoxydable à extrémité émoussée. Une fois que nous savons que le système est amorcé, nous allons appuyer sur démarrer. Pour commencer l'écoulement du sang, vous appuyez sur arrêt pour l'interrompre, puis vous prenez un tube de centrifugation propre de 1,5 ml ou un tube fendor et nous allons débrancher soigneusement.

Débranchez simplement un, débranchez le tube d'un des ports de l'appareil. Une fois ce tube débranché, nous l'insérerons dans le tube fendor de 1,5 mil. Nous appuierons sur démarrer pour relancer l'écoulement sanguin.

Et lorsque nous voyons une goutte de sang se former, nous arrêtons la pompe et l'insérons dans l'entrée que nous venons d'ouvrir sur le dispositif. Nous appuierons sur « Exécuter » pour démarrer l'écoulement du sang et nous réglerons un minuteur sur cinq minutes. Nous voulons nous assurer que le sang remplit uniformément toutes les chambres et qu'il n'y a aucune bulle d'air évidente dans le dispositif.

S'il y a des bulles d'air qui bloquent l'écoulement dans l'une des chambres, vous pouvez prendre une paire de pinces et les faire glisser le long des petits canaux menant aux chambres de capture ou le long des petits canaux qui sortent des chambres de capture. Ce dispositif se remplit correctement ; après cinq minutes, appuyez sur arrêt sur la pompe à seringue pour interrompre l'écoulement du sang, desserrez la pince de la seringue et retirez-la du support de la pompe à seringue. Ensuite, nous allons utiliser la seringue numéro trois, chargée de PBS sans nucléase. Nous allons utiliser cette seringue, et encore une fois, veiller à ce que la surface du dispositif soit bien jointe afin d'éviter toute bulle d'air ; nous tapoterons la seringue pour faire remonter toutes les bulles d'air vers le haut du corps de la seringue.

Desserrez le bras de la pompe à seringue et insérez la seringue de trois millilitres dans la pompe. Serrez-la, puis poussez le piston jusqu'à ce qu'il entre en contact avec le piston de la seringue. Nous appuyons sur « exécuter » et attendons que le liquide purge l'appareil, puis nous attendons de voir une gouttelette à l'extrémité de l'aiguille en acier inoxydable.

Lorsque vous voyez une goutte se former, vous arrêtez la pompe. Nous allons retirer le sang, la pointe en acier inoxydable qui contient le sang. Nous allons insérer la solution de lavage et appuyer sur démarrer.

Et nous allons laisser fonctionner cela pendant cinq minutes. Vous devez prendre un essuie-tout propre et essuyer toute petite quantité de sang qui pourrait se trouver à l'entrée ou à la sortie. Après cinq minutes de passage du tampon de lavage à travers le dispositif, celui-ci doit être entièrement débarrassé de tout sang, ce que vous pouvez constater par l'absence totale de sang rouge dans le dispositif, qui apparaîtra alors transparent. Ce que nous allons donc faire, c'est qu'après les cinq minutes, nous allons arrêter l'écoulement du tampon de lavage.

Et encore une fois, nous allons retirer la seringue de la pompe à seringue. Nous allons boucher le tube de microcentrifugation de 1,5 ml directement sur le tube de sortie flexible. Puis nous allons soulever délicatement le tube, le tube de microcentrifugation, en tirant doucement le tube de déchet hors du dispositif.

Nous allons jeter cela dans un conteneur de déchets biologiques. Le kit contient un nouveau tube de sortie, qui est en réalité fabriqué en téflon. Il possède à nouveau une pointe en acier inoxydable.

Nous allons remplacer le tube de sortie ancien par ce nouveau tube de sortie. Nous allons prendre ce tube de sortie et tenter de le plier en forme de U ou de V. Le kit comprend également une colonne de broyage kaya, qui cisaille l'ADN et homogénéise essentiellement votre lysat cellulaire.

Nous allons donc ouvrir le bouchon violet de la colonne broyeuse et placer le tube de sortie dans la colonne Kay Shredder. Nous allons sortir du kit la seringue numéro deux, indiquée « pour RLT », que nous allons utiliser. Il s'agit d'une seringue BD standard de 1 ml avec une embout contondant en acier inoxydable de calibre 22.

Nous allons utiliser cela pour injecter 350 microlitres de RLT standard provenant de kyogen dans le dispositif. Étant donné que le dispositif présente un volume mort d’environ 50 microlitres, ce que nous voulons faire, c’est injecter le RLT, mais derrière le RLT, nous souhaitons injecter un bouchon d’air afin de libérer ce volume mort du dispositif dans la colonne du broyeur à chi. La méthode consiste donc à prendre notre seringue, à tirer et à aspirer 350 microlitres d’air, puis à ajouter 350 microlitres (ou 0,35 ml) de RLT, de sorte que le RLT se retrouve maintenant au fond de la seringue.

Résistez à la tentation de retourner la seringue et d'injecter l'air. L'air est présent pour s'assurer que nous récupérons tout le RLT dans notre colonne Kay shredder. Nous allons retirer le tube du tampon de lavage.

Nous allons insérer notre seringue contenant le RLT et injecter lentement le RLT dans l'appareil sur une période d'environ 30 secondes, en veillant à ce que le tube de sortie évacue ses déchets vers la colonne Kay Shredder. Dès que l'air commence à être injecté dans l'appareil, appuyez sur le piston de la seringue et attendez que tout le liquide soit expulsé dans la colonne Kay Shredder. Nous fermons la colonne Kay Shredder et la centrifugeons dans une microcentrifugeuse équilibrée à 15 000 tr/min ou à la vitesse maximale d'une microcentrifugeuse de banc pendant deux minutes.

Après avoir centrifugé la colonne pendant deux minutes, nous allons prélever l'échantillon, qui se trouve désormais dans du RLT, et le placer dans un des cryotubes fournis avec un bouchon violet. Si vous travaillez avec un échantillon clinique, vous étiqueterez ces cryotubes au début de l'expérience. Voici le lysat dans le cryotube.

Cette ampoule cryogénique est immédiatement placée dans un congélateur AC à moins 80 degrés et conservée en vue de l'expédition ou d'une extraction ultérieure d'ARN. Il s'agit donc d'un protocole alternatif pour l'isolement des neutrophiles. Au lieu de lyser les cellules avec un tampon RLT, nous allons les colorer avec une coloration histologique standard.

Une tache. Nous sortons donc le dispositif scellé du sac et nous le déballons à nouveau, nous notons le numéro de lot sur le dispositif et nous plaçons la boîte de Pétri dans le support de boîte de Pétri.

Nous allons prendre la seringue de un millilitre hors de son sachet, la seringue numéro un, et la charger avec 700 microlitres de sang, puis injecter la moitié, soit 350 microlitres, dans un tube EEND DPH. Nous mettrons celui-ci de côté. Prenons ensuite la seringue numéro quatre, qui possède le tubage que nous utiliserons pour l'insertion, et injectons le sang dans le dispositif.

Il faudra tenir la base de l'aiguille à partir de l'extrémité du tube de manière chimique. Retirer le corps de la seringue et remplir l'appât. L'adaptateur tamponnerait et éliminerait cette seringue.

Nous insérerons la seringue contenant le sang dans l'aiguille en utilisant un essuie-tout chimique pour recueillir tout débordement. Nous tapoterons la seringue pour éliminer les bulles d'air présentes au niveau de la jonction entre l'aiguille et le corps de la seringue. Nous chargerons la seringue dans la pompe à seringue, puis nous amorcerons le tube en abaissant le bras mobile de la pompe à seringue.

Nous allons déconnecter le tube d'une des sorties de l'appareil, le dispositif de capture, et l'insérer dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. Ensuite, nous allons commencer à faire circuler le sang en appuyant sur « run » (démarrer) sur la pompe à seringue. Nous attendrons la formation d'une goutte de sang à l'extrémité en acier inoxydable.

Une fois la goutte formée, appuyez sur stop, essuyez ce sang, insérez-la dans le dispositif et appuyez sur exécuter. Nous réglons maintenant un minuteur sur cinq minutes. Bon, après avoir circulé dans le dispositif pendant cinq minutes, appuyez sur stop sur la pompe à seringue et relâchez la seringue.

Nous allons remplacer cette seringue par la seringue de trois millilitres contenant notre tampon de lavage, qui est simplement du 1 XPBS. Encore une fois, nous devons nous assurer que le haut du dispositif est bien fermé, puis nous allons retirer l'embout de l'aiguille contenant le sang ou le run plus. Commencez à amorcer le dispositif.

Nous allons former des gouttelettes, insérer celles-ci dans le dispositif et appuyer sur « exécuter ». Nous essuyons tout sang présent au niveau du tube d'entrée ou de sortie, puis laissons s'écouler pendant cinq minutes après l'étape de lavage. Ensuite, nous arrêtons la pompe à seringue et retirons la seringue du support de la pompe. Pour réaliser une conservation GIM standard, nous allons d'abord fixer les cellules et les déshydrater à l'aide de méthanol à 100 %.

Nous disposons donc d'une seringue de trois millilitres préchargée avec du méthanol. Encore une fois, nous allons amorcer la seringue, vérifier que le méthanol s'écoule, arrêter la pompe de la seringue, l'insérer dans l'appareil, puis appuyer sur « exécuter ». Nous allons les fixer dans cette solution de méthanol pendant deux à quatre minutes.

Après deux à quatre minutes de fixation au méthanol, nous arrêtons la pompe, retirons la seringue contenant le méthanol, puis nous chargeons une seringue de trois millilitres contenant du EEM Sustain Standard EEM Sustain de Sigma, dilué au 1/5 dans de l’eau déionisée. Après dilution, nous chargeons la solution dans la seringue, puis, à l’extrémité de celle-ci, nous fixons un filtre de 0,8 micron afin d’éliminer toute particule susceptible de boucher l’appareil. L’incubation avec le colorant dure de cinq à dix minutes.

Ensuite, nous rincerons avec de l’eau désionisée. Après une coloration de cinq à dix minutes, nous arrêterons la pompe à seringue et remplacerons la seringue contenant le tampon de coloration par une seringue remplie d’eau désionisée. Nous effectuerons essentiellement un lavage jusqu’à ce que la couleur bleue du SAI ait disparu du dispositif. Une fois que l’excès de gim sustain a été éliminé par rinçage, nous arrêtons la solution de lavage.

Ensuite, nous allons retirer la seringue d'eau de l'entrée. Puis nous allons prendre le tube de sortie du dispositif. Nous allons saisir ce tube à l'extrémité à l'aide de nos pinces.

Il s'agit d'un tube flexible en tigon que nous allons réinsérer dans l'orifice d'entrée du dispositif. Cela scelle l'appareil et maintient les cellules hydratées ainsi que leur morphologie intacte. Maintenant, mon collègue, le Dr John Hong Chang, va présenter un protocole alternatif d'isolement des lymphocytes CD4 positifs, suivi d'une coloration immunofluorescente directement à l'intérieur du dispositif microfluidique.

Je m'appelle Shong Hong et aujourd'hui, je vais vous démontrer la coloration cellulaire dans un dispositif microfluidique. À ce stade, je peux déjà vous montrer comment utiliser un dispositif d'isolement par affinité immuno-microfluidique pour isoler spécifiquement des cellules sanguines à partir de sang entier, sans précédent. Dans ce but, il souhaite lyser les cellules afin d'obtenir les protéines et l'ADN provenant de ces cellules isolées. Pour ma part, dans le cadre de mes recherches, je souhaite obtenir les cellules puis effectuer un décompte cellulaire, par exemple déterminer le nombre de cellules CD4 à partir de sang entier, et utiliser ce paramètre comme indicateur à des fins diagnostiques.

Ainsi, le dispositif utilisé est très similaire au dispositif de Ken. Il est fabriqué en P-D-M-S-A avec une chambre droite. La géométrie est légèrement différente, de sorte que les paramètres de fonctionnement sont légèrement différents, bien que, de manière générale, la procédure opératoire globale soit très similaire.

Je vais donc passer toutes les étapes de capture et de rinçage des cellules et passer directement à l'étape de marquage cellulaire dans les procédures de dénombrement cellulaire. Ici, j'ai un dispositif dans lequel la moitié des cellules a déjà été capturée à partir de sang total, et le dispositif a déjà été rincé au PBS. Les cellules en excès ont déjà été éliminées du dispositif, et j'ai préparé à l'avance un mélange d'anticorps utilisé spécifiquement pour marquer les cellules que j'ai isolées dans le dispositif.

Ainsi, la concentration d'anticorps que nous avons utilisée ici a été optimisée pour marquer les cellules avec une intensité fluorescente très élevée au microscope à fluorescence. La procédure est donc assez simple. Nous chargeons la seringue remplie de la solution d'anticorps sur la pompe à seringue, puis nous nous assurons que le débit est réglé aux paramètres appropriés dont nous avons besoin.

Ensuite, nous allons démarrer la pompe à seringue, observer l'extrémité du tube et nous assurer que la solution s'écoule déjà, afin qu'il n'y ait plus aucune bulle dans le tube. Puis, nous pouvons brancher le tube au dispositif microfluidique dans lequel nous avons piégé les cellules. À présent, l'anticorps circule dans le dispositif pour marquer les cellules que nous avons isolées à l'intérieur. Le débit utilisé ici est de cinq microlitres par minute, mais selon la géométrie du dispositif, différents paramètres d'écoulement peuvent être adaptés à vos besoins.

Et nous laisserons circuler la solution d'anticorps pendant cinq minutes, ce qui représente un volume suffisant pour remplacer entièrement la solution dans le canal microfluidique. Ainsi, après l'injection d'anticorps, nous arrêterons l'écoulement. Nous faisons donc circuler l'anticorps à raison de cinq microlitres par minute pendant cinq minutes afin de remplacer toute la solution présente dans le microcanal.

Ensuite, nous arrêtons le flux et laissons le dispositif incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Cette étape doit être réalisée à l’abri de la lumière afin que l’anticorps ne soit pas éteint, car les anticorps fluorescents peuvent être éteints pendant que les cellules sont incubées avec l’anticorps de marquage. Après une coloration d’une durée habituelle de 15 à 30 minutes, nous déconnectons simplement le tube du dispositif et remplaçons la seringue contenant l’anticorps par une seringue contenant du tampon, afin de laver l’anticorps non lié présent dans le dispositif.

Ainsi, la solution de lavage contient ici 1 % de BSA dans une solution PBS. La BSA sert à bloquer la liaison non spécifique de l'anticorps à la surface, et nous ferons la même chose. Tout d'abord, nous ajustons le débit sur la pompe à seringue afin de nous assurer qu'il correspond bien au débit souhaité, puis nous démarrons la pompe à seringue et vérifions qu'un liquide s'écoule effectivement du tube avant de le brancher au dispositif.

Le but de cette étape est d'éliminer toute bulle résiduelle dans le tube. Ainsi, lors de l'injection, aucune bulle n'entre dans notre dispositif. Nous branchons donc simplement le tube au dispositif et laissons le liquide circuler pendant cinq minutes supplémentaires afin de remplacer complètement le liquide de lavage et éliminer tous les anticorps non liés du dispositif.

Après l'étape de lavage, nous fixerons les cellules avec du PFA à 1 %. L'objectif de cette étape est de permettre le stockage du dispositif pendant quelques semaines, au cas où l'acquisition d'images ne pourrait pas être effectuée immédiatement. La procédure est donc très simple.

Il s'agit d'une procédure similaire à celle que nous avons effectuée précédemment. Nous chargeons la seringue dans la pompe, réglons le débit souhaité, puis nous démarrons la pompe à seringue et raccordons le tube à notre dispositif afin d'injecter la solution de paraformaldéhyde, qui est le fixateur, dans notre dispositif pour fixer les cellules. Là encore, nous laissons s'écouler le liquide pendant environ cinq minutes.

Ainsi, le PFA remplace tout le tampon dans le dispositif pour fixer toutes les cellules présentes. Après l'étape de fixation au PFA, on retire simplement la seringue contenant le PFA, et le dispositif est alors prêt pour l'imagerie. Dans certains cas, les chercheurs souhaitent effectuer une coloration du noyau afin de la superposer à la coloration de leurs marqueurs de surface cellulaire.

Pour ce faire, on réalisera une coloration des noyaux à l’aide de DPI à la fin. On charge donc la seringue de DPI, on met en marche la pompe à seringue et on fait circuler le DPI dans notre dispositif. Les noyaux seront ainsi colorés dans ces cellules afin d’en montrer la localisation.

Et cette image de coloration au DPI peut ensuite être superposée à l’image de coloration des marqueurs de surface afin de montrer la localisation des cellules. Ainsi, à la fin de la coloration au DPI, nous devons à nouveau rincer le DPI lié avec une solution tampon. Nous utilisons donc à nouveau du PBS contenant 1 % de BSA pour éliminer le DPI non fixé.

Et l'opération est similaire à celle que nous avons effectuée précédemment. Nous insérons simplement la seringue de tampon dans notre dispositif et laissons le tampon circuler dans le dispositif afin de rincer le dap non lié. Voilà donc l'ensemble de la procédure de marquage des cellules dans un dispositif microfluidique.

Et après toutes les procédures de coloration, les dispositifs sont prêts pour l'acquisition d'images. Et comme nous avons effectué une fixation au PFA, les dispositifs peuvent également être conservés pendant quelques semaines si l'acquisition d'images ne peut pas être réalisée immédiatement.