Assay saccharification haut débit pour les matériaux lignocellulosiques

Bonjour, je suis Kara Ted, je suis Leo. Allez, c'est moi. Et je suis Simon McQueen Mason.

La digestibilité de la biomasse végétale est un sujet d'un grand intérêt à l'heure actuelle. En effet, une grande quantité de sucres est piégée dans les polysaccharides des parois cellulaires végétales qui constituent cette biomasse, et si nous parvenons à extraire ces sucres sous une forme utilisable, nous pourrons les fermenter afin de produire toutes sortes de produits, tels que des carburants et des produits chimiques. Malheureusement, ces matériaux sont extrêmement difficiles à digérer, et il est urgent de mieux comprendre les facteurs qui contrôlent cette digestibilité.

Afin de pouvoir utiliser la matière végétale pour la production de groupes renouvelables, nous devons être en mesure de mesurer le potentiel de fication de ces plantes. Ici, à l'Université de York, nous analysons de grandes populations de matériel végétal afin de déterminer leur potentiel de fication. La fication est le processus de dégradation des glucides complexes en leurs composants monosaccharidiques, permettant ainsi la production de produits chimiques de valeur par divers procédés industriels.

Pour mesurer le potentiel de saccharification, nous reproduisons des procédés industriels à une échelle microscopique où nous soumettons la biomasse à un prétraitement et à une hydrolyse enzymatique afin de déterminer les sucres libérés. Cela permet d'identifier des variétés intéressantes parmi les génotypes. Le système à haut débit fonctionne selon un format de plaque IG à six puits.

Des conditions douces d'hydrolyse sont utilisées pour révéler des différences subtiles entre génotypes, et la méthode est suffisamment souple pour permettre l'utilisation de divers matériaux de substrat ainsi que l'évaluation d'enzymes différentes. La méthode que nous utilisons implique la préparation du matériel végétal sous forme de poudre, qui est ensuite prétraitée avec un acide ou une base dilué à 90 degrés pendant 20 minutes. Ensuite, une digestion enzymatique est réalisée à l'aide d'un mélange commercial de cellulase à 50 degrés pendant huit heures.

Enfin, une méthode MBTH est utilisée pour déterminer la libération de sucres réducteurs. Le matériel végétal est récolté sous forme de tiges sèches, découpées en segments de quatre millimètres. Ceux-ci sont placés dans des vials de deux millilitres contenant trois billes métalliques de cinq millimètres.

Les vials sont étiquetés individuellement avec des codes-barres, qui sont scannés afin d'assurer la traçabilité des échantillons. Les échantillons sont chargés dans les robots de broyage et de formatage. Les échantillons sont broyés et mélangés automatiquement afin de permettre la distribution de la biomasse dans une plaque de 96 puits.

Les flacons sont perforés, puis le flacon est repositionné dans le bras robotisé de manière à se trouver à l'intérieur d'un entonnoir qui vibre pour distribuer la poudre. La vibration de l'entonnoir est régulée par une balance afin d'obtenir la quantité cible en masse par puits distribuée. La biomasse est distribuée dans 10 colonnes des plaques, deux colonnes étant réservées aux étalons.

En effectuant quatre répétitions par échantillon, nous chargeons 20 échantillons par plaque. L'hydrolysat de cette plaque sera réparti en trois exemplaires dans des plaques PCR, produisant ainsi trois plaques optiques. De cette manière, nous obtenons trois déterminations de sucres réducteurs par puits de biomasse.

Une fois préparées, les plaques sont scellées avec un tapis en silicone afin d'éviter l'évaporation. Lorsqu'elles sont prêtes, elles sont transférées vers le robot de manipulation des liquides. Sur ce robot, le prétraitement, l'hydrolyse enzymatique et la détermination des sucres libérés sont effectués automatiquement.

La table de deux mètres comporte des compartiments pour les différents réactifs nécessaires, ainsi qu'un espace de rangement pour la vaisselle plastique. Des incubateurs sont prévus pour le prétraitement et l'hydrolyse, ainsi que des thermocycleurs pour la détermination des sucres. Le prétraitement est effectué dans la plaque à puits profonds.

En ajoutant des solutions acides ou alcalines diluées au poudre de biomasse. Les plaques sont transférées sur le bloc chauffant et incubées à 90 degrés pendant 20 minutes. Une fois cette incubation terminée, le prétraitement est éliminé par cinq rinçages avec 500 microlitres de tampon acétate.

Une fois le prétraitement rincé, un cocktail d'enzymes est ajouté. Il s'agit d'un mélange standard contenant de la cellulase et du Novozyme 188 dans un rapport de quatre pour un, à une concentration de sept UFP par puits.

Les plaques sont incubées pendant huit heures à 50 degrés sous agitation. 75 microlitres de l'hydrolysat obtenu sont transférés dans une plaque PCR. Dans les colonnes 11 et 12 des plaques PCR, on ajoute les étalons de glucose.

Ensuite, 25 microlitres d'une solution d'hydroxyde de sodium à un molaire sont ajoutés à tous les puits. Enfin, 50 microlitres de réactif MBTH sont pipetés dans la plaque PCR. La plaque à puits profonds est stockée après l'achèvement du transfert de l'hydrolysat vers la troisième plaque PCR.

Alors que les plaques de PCR sont transférées dans les thermocycleurs pour une incubation à 60 degrés pendant 15 minutes. La dernière étape du processus consiste à transférer le mélange réactionnel dans des plaques optiques afin de développer la couleur. Après l'incubation, les plaques de PCR sont retirées du thermocycleur.

Cent microlitres de réactif oxydant sont ajoutés au mélange réactionnel transféré. Pour faciliter le développement de la couleur, le processus de manipulation liquide est effectué quatre fois en 24 heures, la rinçage de prétraitement et l'ajout d'enzyme prenant environ deux heures. L'hydrolyse enzymatique dure huit heures, et la détermination du sucre prend deux heures supplémentaires.

Pendant que la première plaque est incubée pendant huit heures, la plaque suivante commence le processus. Grâce à cette répartition des ressources robotisées, un débit de trois cycles permettant d'analyser 80 échantillons par jour est atteint afin de déterminer la quantité de sucres réducteurs libérés. Les plaques sont lues à 620 nanomètres.

Les résultats obtenus sont analysés afin de quantifier les sucres libérés en nanomoles par milligramme par heure de réaction. Merci donc d'avoir regardé, et j'espère que cela inspirera vos recherches dans le domaine des biocarburants.