Visualisation de la fonction respiratoire mitochondriale utilisant Cytochrome C Oxydase / succinate déshydrogénase (COX / SDH) Double-histochimie étiquetage

L'objectif général de cette procédure est de permettre la visualisation directe des déficiences des enzymes respiratoires mitochondriales dans des coupes de tissu fraîchement congelé. Cela est réalisé en prélevant d'abord des sections au cryostat à partir de l'organe d'intérêt. La deuxième étape de la procédure consiste à réaliser l'histochimie de la COX, suivie de l'histochimie de la SDH.

Enfin, les coupes de tissu sont déshydratées, montées et recouvertes d'une lamelle. En définitive, les résultats peuvent montrer le degré de dysfonction mitochondriale par l'intensité de la coloration bleue cellulaire. Bonjour. Aujourd'hui, nous allons parler de la technique histochimique de double marquage COX-SCH.

Et bien que cette méthode puisse être appliquée à l'étude des maladies mitochondriales, elle peut également fournir des informations sur le vieillissement et les troubles liés à l'âge. Après avoir prélevé le cerveau d'un animal sacrifié conformément à une autorisation éthique, le congeler rapidement sur de la glace sèche. Le tissu congelé peut être conservé à moins 80 degrés Celsius, enveloppé dans du papier d'aluminium, jusqu'au moment de la sectionnement.

Préparez le tissu pour la cryocoupe en plaçant le cerveau sur un porte-échantillon de cryostat et en l'entourant de composé d'inclusion. Placez rapidement le porte-échantillon dans le cryostat et récupérez des sections de 14 micromètres à moins 21 degrés Celsius. Faites fondre les sections sur des lames à l’aide d’un bloc chauffant, puis laissez les lames sécher à température ambiante pendant une heure.

Placer les lames dans une chambre de coloration pour lames avec des bandes de papier humide. Étant donné que les durées de réaction sont importantes dans ce dosage, il est recommandé de traiter au maximum 10 lames par expérience sous une hotte chimique. Préparer l'incubation, le milieu contenant du DAB et du cytochrome C dans du PBS, puis vortexer.

Ajoutez rapidement deux microgrammes de CDE de bovin au milieu et mélangez soigneusement par vortex. Pour disperser tous les grains de CDE encore présents sous la hotte, appliquez de 150 à 200 microlitres de milieu d'incubation sur chaque lame à l’aide de la pointe de pipette afin de répartir uniformément sur toutes les sections. Incubez les lames pendant 40 minutes à 37 degrés Celsius.

Après 40 minutes, retirez le milieu d'incubation des lames. Lavez les lames quatre fois dans du PBS pendant 10 minutes à chaque fois. Après le lavage des lames, remettez-les dans la chambre de coloration avec des bandes de papier humide, en travaillant sous une hotte chimique.

Préparez la solution de NBT dans le PBS en prenant soin de protéger le PMS de la lumière ; vortexez rapidement la solution, puis appliquez 150 à 200 microlitres de la solution de NBT sur chaque lame en utilisant la pointe de pipette pour répartir uniformément sur toutes les sections. Incubez les lames pendant 40 minutes à 37 degrés Celsius ; au bout de 40 minutes, retirez l'excès de solution des lames. Lavez les lames quatre fois dans le PBS pendant 10 minutes à chaque fois.

Hydrater les lames pendant deux minutes chacune dans les concentrations d'éthanol suivantes, en ordre séquentiel : 70 %, 70 %, 95 %, 95 % et 99,5 %. Enfin, laisser 10 minutes dans une étape supplémentaire à 99,5 %. Placer les lames dans le xylène pendant 10 minutes, monter avec LAN et appliquer les lamelles.

Laissez sécher les lames toute la nuit ou au moins de une à deux heures dans un endroit ventilé ici. Des sections cérébrales provenant de souris de type sauvage et de souris Mutator de l'ADNmt vieillissant prématurément ont été marquées successivement pour les activités de la COX et de la SDH.

L'activité normale de la Cox indiquée par la coloration brun foncé est observée dans l'hippocampe de souris de type sauvage. Des déficiences en Cox, indiquées par la coloration bleue, ont été mises en évidence dans l'hippocampe de souris mutatrices de l'ADN mitochondrial à 12 et 46 semaines. Une diminution supplémentaire de l'activité de la Cox a été observée à 46 semaines chez les souris mutatrices de l'ADN mitochondrial, suggérant une aggravation généralisée du dysfonctionnement de la chaîne respiratoire.

Des durées d'incubation insuffisantes de 10 et 25 minutes ont entraîné une réduction du dépôt du produit de réaction brun de la DAB. Les durées d'incubation raccourcies ont permis la formation du produit final bleu de Foran pendant l'incubation de la SDH, suggérant à tort la présence de cellules présentant des carences en COX lors de la pose du coverslip. Les lames pendant l'incubation de la COX ont également conduit à une formation et un dépôt inexactes du produit de réaction de la DAB.

Bien que les activités de la Cox et de la SDH puissent être marquées individuellement comme indiqué ici, le marquage séquentiel s'est révélé avantageux pour localiser les cellules présentant un dysfonctionnement mitochondrial. Un exemple de contrôle de spécificité pour les activités de la COX et de la SDH dans le cerveau d'une souris de type sauvage montre une absence de marquage. N'oubliez donc pas que manipuler les produits chimiques utilisés dans le double marquage Cox-SCH, selon ce protocole chimique, présente des risques extrêmement élevés, et que des précautions telles que le port d'une tenue de laboratoire appropriée et d'un masque, le travail sous hotte chimique, ainsi que l'élimination du milieu d'incubation, doivent être prises à chaque réalisation de ce dosage.