Un protocole Chelex simple pour l'extraction d'ADN à partir de

L'objectif général de cette procédure est d'extraire l'ADN du paludisme, du parasite et du moustique à partir des sections du mésentéron et des glandes salivaires de spécimens d'anomalies. Cela est réalisé en coupant d'abord le moustique exactement au niveau de l'articulation entre l'abdomen et le thorax, séparant ainsi le mésentéron de la section des glandes salivaires. Ensuite, chaque section est broyée séparément dans de l'eau déionisée.

Ensuite, la suspension tissulaire est lysée et lavée, et le culot cellulaire est récupéré. Enfin, le culot cellulaire est reconstitué et porté à ébullition, puis l'ADN est extrait. En définitive, des résultats peuvent être obtenus montrant un ADN de haute qualité provenant de moustiques et de parasites du paludisme, adapté à une utilisation comme matrice pour identifier des anomalies, les espèces de vecteurs et les génotypes des infections palustres par PCR et digestion par enzyme de restriction spécifique d'allèle.

Le principal avantage de cette technique très simple par rapport aux méthodes existantes, telles que l'extraction organique et les méthodes de tri, réside dans l'utilisation d'un nombre très limité de réactifs sûrs et facilement disponibles, ainsi qu'un temps de traitement nettement réduit. Pour commencer à disséquer le moustique, placez-le sur un petit morceau de paraffine et fixez-le sur un microscope stéréoscopique. Recouvrez-le d'une goutte d'eau déionisée.

Pour ramollir le tissu en taille, incisez précisément la carcasse du moustique au niveau de l'articulation entre le thorax et l'abdomen. Ainsi, détachez la tête et le thorax de la section abdominale. Transférez chaque section de moustique disséquée dans un tube propre de microcentrifugeuse stérilisé de 1,5 millilitre, préalablement étiqueté avec le numéro d'identification du moustique et la section corporelle ; jetez le film parafilm et, à l’aide d’un essuie-tout Kim imbibé d’alcool à 70 %, nettoyez soigneusement le plateau du microscope avant de passer au moustique suivant. Pour extraire l’ADN du moustique, aspirez d’abord 20 microlitres d’eau désionisée dans le tube d’échantillon.

Et utilisez la pointe de pipette pour broyer la section de moustique immergée afin d’obtenir une suspension homogène. Ajoutez 100 microlitres d’une solution d’autoclave, PBS 1x contenant 1 % de saponine, au homogénéat d’échantillon et mélangez délicatement par vortex. Incubez l’échantillon à température ambiante pendant 20 minutes.

Ensuite, centrifuger à 20 000 G pendant deux minutes et éliminer le surnageant. Resuspendre le culot dans 100 microlitres de PBS 1X. Répéter ensuite la centrifugation.

Ajoutez 75 microlitres d'eau déionisée stérile et 25 microlitres de suspension de résine Cellex 100 à 20 % poids/volume dans de l'eau déionisée, puis vortexez doucement pour resuspendre le culot à l’aide d’une aiguille hypodermique stérile de calibre 23, flamée au bec Bunsen. Percez un trou dans le couvercle du tube d’échantillon.

Faites bouillir la suspension d'échantillon dans un bloc chauffant pendant 10 minutes. Centrifugez à 20 000 G pendant une minute, puis transférez la solution d'ADN dans un flacon de stockage pré-étiqueté pour utilisation comme matrice dans des réactions de PCR afin de vérifier la qualité de l'ADN extrait, en amplifiant une région du gène mitochondrial de la sous-unité quatre de la nicotinamide adénine dinucléotide déshydrogénase des arthropodes, dont on s'attend à ce qu'elle produise un fragment de 400 paires de bases. Ensuite, pour différencier les espèces du complexe Ananais Gambia, amplifiez une région encadrant les SNP située dans la région espacer intergénique, dont on s'attend à ce qu'elle produise des tailles de 390 paires de bases pour Ananais Gambia Sensu Stricto et de 315 paires de bases pour Ananais api.

Analyser ensuite les polymorphismes de résistance aux médicaments antifolates chez *P. falciparum* par génotypage. Réaliser une PCR imbriquée pour amplifier la région encadrant les codons des acides aminés 16, 51, 59, 108 et 164. Dans le gène de la dihydrofolate réductase des parasites, effectuer une digestion allèle-spécifique de l'amplicon afin de détecter la résistance aux médicaments antifolates.

Polymorphismes associés. Examiner les réactions sur un gel AROS à 2 %. Des exemples de résultats obtenus par PCR pour l'analyse de la qualité des extraits d'ADN de moustiques, l'identification moléculaire RABIS et le génotypage de *P. falciparum* montrent que la méthode Kelex simplifiée donne des résultats similaires à ceux du protocole standard de précipitation par sel, malgré moins d'étapes et moins d'un quart du temps requis, avec une qualité d'ADN comparable dans les extraits respectifs. Il n'est donc pas surprenant que les taux de positivité des échantillons vis-à-vis des anomalies, des espèces sœurs de *Gambia*, ainsi que les taux d'infection parasitaire, n'aient pas été statistiquement différents selon le test du chi carré de McNemar.

L'ajout de BSA aux mélanges de réaction entraîne une augmentation générale des résultats positifs en PCR grâce à l'élimination des inhibiteurs de la PCR, tant pour le protocole Kelex simplifié que pour le protocole classique par précipitation salée. Toutefois, cette augmentation n'était pas statistiquement significative, sauf en ce qui concerne la qualité de l'ADN des extraits Kelex. La digestion par des enzymes de restriction spécifiques d'allèles de l'amplicon de *P. falciparum* permet le génotypage des infections du mésentère et des glandes salivaires à paludisme pour les allèles de résistance aux médicaments, une fois la technique maîtrisée.

Cette technique devrait pouvoir être réalisée en environ 37 minutes si elle est effectuée correctement.