Évaluation de la migration des cellules souches du cancer utilisant compartimenter dispositifs microfluidiques et imagerie des cellules vivantes

L'objectif général de cette procédure est d'observer visuellement et de caractériser la migration de cellules cancéreuses à l'aide d'un dispositif microfluidique compartimenté. Cela est réalisé en dissociant d'abord des neurosphères préexistantes de cellules souches de tumeurs cérébrales cultivées dans un milieu sans sérum. La deuxième étape consiste à fabriquer un master en SU-huit bicouche et à utiliser un moule en A-P-D-M-S réalisé par lithographie douce, présentant un design compartimenté.

Ensuite, assemblez le dispositif microfluidique et chargez-le avec des cellules souches de tumeur cérébrale. Enfin, une imagerie en laps de temps à long terme de la migration des cellules souches de tumeur cérébrale est réalisée à l’aide d’un système microscopique tout-en-un. En définitive, les résultats montrent que les cellules souches de tumeur cérébrale présentent une séquence rotative de stades morphologiques au cours de leur migration à travers des espaces ultra-confinés.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux dispositifs existants comme la chambre Transwell Boyton réside dans le fait que le microdispositif permet l'inspection visuelle du processus de migration, le positionnement contrôlé des cellules et l'administration précise de facteurs. Par conséquent, la technologie microforic offre des caractéristiques de sélection et de guidage cellulaire unique fiables, efficaces et rentables. Les implications de cette technique s'étendent au traitement des métastases et de la récidive du cancer, car l'analyse de cellules uniques hautement migratrices pourrait identifier des cibles chimiothérapeutiques potentielles futures.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le comportement migratoire des systèmes cancéreux, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes tels que le développement embryonnaire, les réponses immunitaires, la cicatrisation des plaies et la régénération d'organes. Commencez par la suspension cellulaire de neurosphéroïdes dérivés de BTSC. Rassemblez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez-les à 900 tr/min pendant cinq minutes, mais pas plus vite.

Aspirez le surnageant. Ensuite, laissez les neurosphères se détacher en les incubant dans 0,5 millilitre d'Accutase préchauffé pendant cinq à dix minutes à 37 degrés Celsius. Après l'incubation, dissocierez mécaniquement les cellules à l'aide de 10 à 20 mouvements doux avec une pipette P100.

Ensuite, ajoutez 1,5 millilitre de milieu pour cellules souches pour neutraliser l'Accutase, centrifugez la suspension cellulaire à 1300 tr/min pendant cinq minutes et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de milieu pour cellules souches. Vérifiez la densité cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et ajustez la densité à 20 000 cellules par microlitre. Pour commencer la fabrication du moule maître en SU-8, préparez deux masques photo à l’aide d’Adobe Illustrator et d’un film transparent imprimé au laser avec un Image Setter intégré.

Le masque photo de la première couche comprend deux marqueurs fiduciaux et un réseau de microcanaux, tandis que la deuxième couche du masque photo comporte les chambres de positionnement et de réception. Nettoyez les deux couches du masque avec de l'isopropanol et laissez-les sécher à l'air. Appliquez ensuite par rotation un photo-résist SU eight d'une épaisseur de trois microns sur une galette support, suivie d'une cuisson douce.

Ensuite, à l’aide du premier masque photolithographique en contact étroit avec les rayons UV, exposer la photo-résine et laisser durcir. Puis effectuer une cuisson postérieure et développer la plaquette durcie. Recouvrir les zones des marqueurs de repérage de la plaquette de manipulation avec du ruban adhésif Scotch.

Ensuite, appliquez par centrifugation une résine photosensible d'une épaisseur de 250 micromètres sur la plaquette. Puis, retirez le ruban adhésif afin de faire apparaître les marques servant à l'alignement. Appliquez une deuxième couche de résine photosensible et alignez les marques de repère.

Ensuite, exposer sous UV et durcir le masque photo de la deuxième couche, puis effectuer une cuisson postérieure et un développement. Procéder maintenant au silanisation du moule en SU-8 par dépôt en phase vapeur afin de réduire l'adhérence de surface. Placer les plaquettes dans un dessiccateur contenant plusieurs gouttes de solution de trichlorosilane sous vide pendant au moins une heure.

La matrice sera alors prête à être utilisée pour mouler le PDMS. Commencez par mélanger soigneusement la base de prépolymère avec le réactif de réticulation dans un rapport de 10 à 1. Ensuite, placez le mélange dans un dessiccateur sous vide pour dégazer, jusqu'à ce qu'aucune bulle d'air ne soit visible.

Verser le mélange sur le masque et dégazer à nouveau. Si de nouvelles bulles d'air apparaissent, durcir le moule sur une plaque chauffante de niveau pendant deux heures à 90 degrés Celsius. Après refroidissement à température ambiante, retirer délicatement le tampon en PDMS.

Ainsi, les canaux de culture sont gravés dans le PDMS et prêts pour l'assemblage du dispositif microfluidique. Le modèle peut être réutilisé pour le moulage jusqu'à ce qu'il se fende ou s'use. Lorsque le modèle devient collant, le revêtement anti-adhésif peut être réappliqué.

Commencez par créer des entrées et des sorties dans le dispositif microfluidique à l’aide du tampon en PDMS. À l’aide d’un poinçon de biopsie, nettoyez le tampon en PDMS en l’immergeant dans de l’éthanol à 70 % pendant 30 minutes, puis rincez-le à l’eau déionisée pendant 10 minutes. Stérilisez le tampon en PDMS et terminez les réactions de réticulation par autoclavage.

Placez maintenant le tampon en PDMS sur une lamelle en verre revêtue de poly-L-lysine. Le dispositif est ensuite revêtu d'une couche de laminine en remplissant les chambres avec une solution de laminine par les entrées des réservoirs et en incubant toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, aspirez la laminine du dispositif.

Ensuite, lavez l'appareil en l'inondant deux fois avec du milieu pour cellules souches. Chargez maintenant 11 microlitres de cellules dissociées dans l'un des réservoirs d'ensemencement. Si nécessaire, utilisez une aspiration sous vide pour forcer les cellules dans la chambre. Chargez ensuite un volume supplémentaire de sept microlitres de cellules dans le réservoir d'ensemencement adjacent.

Après cinq minutes, les compartiments d'administration et de réception seront remplis de milieu. Placez maintenant une feuille stérile de PDMS d'une épaisseur comprise entre 0,5 et un millimètre sur le dispositif. L'adhésion naturelle de surface du PDMS sur lui-même scellera le dispositif ; une fois scellé, il est prêt à être transporté, incubé et observé en microscopie.

Pré-équilibrez le biot, IM en le faisant fonctionner pendant 45 minutes. Pour stabiliser sa température, son humidité et son apport d'air, ajoutez plusieurs boîtes de Petri contenant de l'eau dans la chambre d'échantillonnage afin d'obtenir l'humidité appropriée. Chargez le dispositif préparé dans la chambre d'échantillonnage du microscope.

Centre l'appareil à l'aide de pinces microscopiques. Définis maintenant les points de mise au point et les points temporels à l'aide du logiciel Biot et démarre les enregistrements en laps de temps si nécessaire. Après cinq jours de culture, remplace le milieu de culture.

Les BTC semées dans le dispositif ont été enregistrées en continu par imagerie en contraste de phase. Pendant cinq jours dans la chambre de sédimentation, les cellules en forme de fuseau sont restées au stade pré-migratoire. Lorsqu'elles se sont approchées de l'entrée du microcanal, quelques cellules se sont étendues et ont formé des protrusions adhésives.

Une seule cellule pouvait occuper l'entrée et explorer la direction de migration. Une fois que la cellule avait déterminé la direction de migration, elle progressait à vitesse élevée et constante à travers tout le microcanal. À l'extrémité du microcanal, la cellule continuait d'explorer l'espace ouvert de la chambre de réception avant d'y pénétrer finalement.

En observant les cellules avec des intervalles d'imagerie de deux secondes, la puissance semblait être générée principalement par une activité de bourgeonnement similaire à celle des cellules OID. Lors de la réalisation de la procédure, il est important de se rappeler que la conception du dispositif est suffisamment souple pour que les dimensions des microcanaux puissent être modifiées afin d'obtenir un degré souhaité de migration cellulaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de créer un dispositif microfluidique compartimenté unique, adapté à la culture de vos cellules d'intérêt, puis de réaliser un suivi en lapse de temps à long terme afin de définir qualitativement et quantitativement les caractéristiques migratoires de ces cellules selon cette procédure.

D'autres méthodes, comme le séquençage de nouvelle génération ou la puce à ADN, peuvent être appliquées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que le degré de différence génétique des cellules cancéreuses hautement migratrices.