Détection multiplex de bactéries dans les échantillons complexes cliniques et environnementaux à l'aide d'oligonucléotides couplés microsphères fluorescentes

Bonjour, je suis Tim Duso d'Agriculture et Agroalimentaire Canada. Dans cette vidéo, nous allons démontrer un protocole permettant de déterminer la présence et l'abondance de micro-organismes spécifiques dans un échantillon clinique ou environnemental complexe à l'aide d'un appareil Bio-Plex. Ce protocole utilise des billes de polystyrène fluorescentes chimiquement couplées à une sonde oligonucléotidique spécifique d'une espèce.

Un amplicon est généré à partir de l'échantillon à l'aide d'amorces PCR universelles, et l'amplicon est hybridé aux billes couplées à la sonde. Deux signaux sont générés avec l'instrument Bio Plex. L'un identifie la bille et l'autre quantifie le signal d'hybridation.

L'objectif général de la procédure est de déterminer un profil de la microflore d'intérêt de manière rapide et semi-quantitative. Nous avons appliqué cette technique pour établir des profils bactériens à partir de prélèvements vaginaux et utiliser les données obtenues pour diagnostiquer la vaginose bactérienne, une affection clinique caractérisée par une modification de la microflore, au cours de laquelle les organismes du genre Lactobacillus deviennent moins abondants tandis que d'autres organismes, tels que Gardnerella, Vais et Apoian Vae, deviennent détectables dans les échantillons vaginaux. Il est toutefois important de garder à l'esprit que cette technique peut être appliquée à toute autre microflore pour laquelle un test multiplex rapide est souhaitable.

Commençons par décrire le fonctionnement de la procédure. Un profil microbien est généré en amplifiant une protéine et en recouvrant le gène chaperon 60 de tous les organismes présents dans un extrait d'ADN prélevé par écouvillon. L'un des deux amorces d'amplification universelles est modifié par l'ajout de biotine, ainsi que par l'incorporation de bases modifiées par un groupement phosphate.

À l'extrémité 5', l'amplicon est rendu simple brin à l'aide de l'exonucléase T7, qui dégrade uniquement le brin antisens. Étant donné que le brin sens est protégé par un nucléotide PCR modifié par un groupement phosphate, des sondes oligonucléotidiques complémentaires au brin restant sont couplées de manière covalente à des billes de polystyrène fluorescentes. Chaque couleur de bille unique contenant une sonde détectant un organisme différent, jusqu'à cent types de billes différents peuvent être utilisés pour un même échantillon.

Le produit PCR monocaténaire provenant du prélèvement vaginal est hybridé à un mélange de billes couplées à des sondes, contenant des sondes spécifiques à tous les organismes d'intérêt. Un marqueur fluorescent FICO ethin est ajouté, qui se lie aux sondes biotinylées par l'intermédiaire d'un conjugué streptavidine. Enfin, le mélange d'hybridation est analysé sur un appareil Luminex ou Bio-Plex, qui examine chaque bille individuellement pour déterminer son identité et le signal d'hybridation.

Les résultats de cette analyse indiquent la présence de microorganismes spécifiques et l'intensité du signal d'hybridation est corrélée à l'abondance de cet organisme. Dans l'échantillon, la présence d'organismes associés à la vaginose bactérienne peut être utilisée pour diagnostiquer la VB. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la coloration de Gram, est qu'elle fournit des informations sur la présence de microorganismes spécifiques ainsi que sur leur abondance.

La procédure sera démontrée par Jennifer Town, assistante de recherche dans notre laboratoire. Résuspendre les microsphères par vortexage pendant environ 20 secondes. Transférer 400 microlitres de microsphères dans un tube centrifuge et centrifuger à 14 000 ×g pendant une minute, puis retirer et jeter le surnageant. Résuspendre les microsphères dans 50 microlitres de MES 0,1 M à pH 4,5.

Ajouter un animo d'oligo de capture aux microsphères et mélanger par vortexage. Ajouter 2,5 microlitres de solution fraîche de EDC aux microsphères. Incuber la réaction à température ambiante pendant 30 minutes à l'abri de la lumière.

Jetez la solution d'EDC préparée précédemment et préparez un nouvel échantillon d'EDC à 10 milligrammes par millilitre dans l'eau. Comme indiqué ci-dessus, ajoutez un autre 2,5 microlitres de solution fraîche d'EDC aux microsphères et vortexez pendant cinq secondes. Incubez à nouveau à température ambiante pendant 30 minutes à l'abri de la lumière.

Lavez les billes en ajoutant un millilitre de 0,02 % de Tween 20, vortexez pour resuspendre les billes, puis centrifugez à 14 000 × g pendant une minute. Retirez et jetez le surnageant. Lavez à nouveau les billes en ajoutant un millilitre de 0,1 % de SDS. Resuspendez les billes dans 100 microlitres de tampon TE.

Compter les billes dans un hémocytomètre afin de déterminer la concentration stock. Préparer un mélange maître de microsphères en diluant chaque bille à une concentration finale de 100 billes par microlitre dans le tampon TE. Rassembler les billes couplées selon le plexus souhaité du test. Conserver le mélange maître de microsphères à quatre degrés à l’abri de la lumière. Ce mélange peut être conservé pendant plusieurs mois s’il est maintenu dans ces conditions. Générer le produit PCR pour chaque échantillon.

Ajouter immédiatement après la PCR le jeu d'amorces modifiées au niveau du phosphate et de la biotine en position cinq prime. Ajouter deux microlitres de l'enzyme T7 exonucléase dans chaque tube de PCR et incuber à température ambiante pendant 40 minutes. À la fin de cette incubation, ajouter 12,5 microlitres de 0,5 molar E-D-T-A-pH 8,0 en mélangeant.

Cela donne un total d'environ 64,5 microlitres de produit PCR simple brin. Resuspendre le mélange maître de microsphères à l'aide d'une pipette. Distribuer une quantité appropriée dans un tube einor.

Fermer le tube et soniquer dans un bain ultrasons pendant deux minutes. Distribuer 17 microlitres de produit PCR simple brin dans les puits appropriés d'une plaque 96 puits bas profil, puis ajouter 33 microlitres de mélange de billes soniquées en suspension à chacun.

Couvrez la plaque avec un couvercle en silicone et tapez doucement. Placez délicatement la plaque dans le thermocycleur avec un programme de 95 degrés pendant cinq minutes, 60 degrés pendant 10 minutes, maintien ou pause à 60 degrés pendant cinq minutes. Fin, démarrez le programme.

Préparez une solution fraîche de strep Aden FICO Ethin. Vous aurez besoin de 25 microlitres par puits. Préparez le strep et le FICO ethin en diluant le stock à un milligramme par millilitre.

Une dilution de 50 à 20 microgrammes par millilitre avec un tampon tmac une fois. Lorsque le thermocycleur atteint l'étape d'incubation à 60 degrés, ouvrez le couvercle, retirez le couvercle en silicone et ajoutez directement la solution de strep din FICO ethin dans chaque puits. Remettez le couvercle en silicone, fermez le couvercle du thermocycleur et reprenez le programme.

Lorsque le programme est terminé, retirez la plaque et transférez-la rapidement vers l'appareil Bio Plex pour la lecture. La plaque doit être lue dans les 10 minutes. Lisez la plaque à 60 degrés.

Veillez à ce que le bio plex ait été préchauffé à cette température. Ceci montre les résultats des colorations de Gram et des profils Luminex correspondants d'échantillons longitudinaux provenant d'un individu unique au temps zéro. La coloration de Gram est conforme à un diagnostic clinique de BV, ce qui est confirmé par un dosage Luminex Fiveplex montrant des signaux d'hybridation positifs pour les organismes associés à la BV, notamment Gardnerella, Atopobium et Aponiella vaginae.

Lactobacillus iners est également détecté à des niveaux faibles au fil du temps. Cet individu passe d'une microflore associée à une vaginose bactérienne (BV) à une microflore normale, comme le montrent les colorations de Gram. L'analyse par Luminex de ces mêmes échantillons montre que l'abondance de Gardnerella vaginalis atteint un pic puis diminue, tandis que Lactobacillus iners augmente pour devenir l'organisme dominant au dernier point temporel.

En utilisant cette méthode pour le profilage de la microflore, des informations sont obtenues sur la présence d'organismes spécifiques ainsi que sur leur abondance. Étant basée sur la séquence, la conception de sondes peut être guidée par une analyse de séquençage profond, permettant ainsi de suivre les micro-organismes identifiés par des méthodes de séquençage de nouvelle génération dans des échantillons, de manière rapide et à coût relativement modique. La visualisation de cette vidéo vous a probablement permis de bien comprendre comment générer un profil microbien à partir d'un échantillon à l'aide d'un appareil Luminex ou Bio Plex.

Nous vous avons montré comment coupler des sondes d'oligonucléotides aux billes fluorescentes, générer un amplicon simple brin à partir d'un échantillon clinique ou environnemental, réaliser l'hybridation et déterminer les résultats sur un appareil Luminex ou Bio Plex. Bonne chance dans vos expériences.