Chambre de circulation à plaques parallèles et de circuit d'écoulement continu pour évaluer les cellules progénitrices endothéliales en cisaillement du flux laminaire

L'objectif général de cet article vidéo est de décrire une technique permettant d'exposer des cellules adhérentes à des conditions d'écoulement laminaire et d'évaluer leur réponse à des contraintes de cisaillement fluide bien quantifiables. Cela est réalisé en assemblant d'abord le circuit d'écoulement sans la chambre d'écoulement. Le circuit comprend le réservoir, l'atténuateur de pulsations, les tubes rigides, les tubes souples, les robinets à quatre voies et les raccords filetés connectés, ainsi qu'un filtre à air.

L'étape suivante consiste à remplir le circuit avec le liquide souhaité, comme le milieu cellulaire en conditions stériles, puis à démarrer la pompe afin de remplir l'amortisseur de pulsation et d'éliminer l'air des tubulures. Suit l'insertion de la lamelle contenant les cellules dans la plaque inférieure de la chambre d'écoulement. La dernière étape de la procédure est l'assemblage complet du circuit d'écoulement, avec la chambre d'écoulement en ligne.

Des résultats finaux peuvent être obtenus, montrant l'alignement de cellules progénitrices endothéliales marquées au fluorochrome sous l'exposition à un stress de cisaillement fluide à travers une chambre transparente, à l'aide d'un microscope à fluorescence. Pour étudier le comportement fonctionnel des cellules, il est souvent nécessaire d'imiter la physiologie in vivo en soumettant les cellules à un stress de cisaillement fluide. Nous avons conçu une chambre d'écoulement à plaques parallèles et un circuit à flux continu, qui nous permettent d'étudier les cellules en conditions d'écoulement et de les observer à travers la chambre transparente.

Cette technique peut servir d'outil de recherche précieux pour les domaines de la médecine et de l'ingénierie. Notre chambre d'écoulement permet une visualisation intermittente ou en temps réel des cellules en écoulement, au moyen d'un microscope droit ou inversé. De plus, le design du Dr. Ach Nick permet aux chercheurs d'observer des cellules sur des surfaces transparentes ou radio-opaques en utilisant des objectifs microscopiques standards.

En outre, il peut servir d'outil important dans la recherche en pharmacologie pour étudier l'effet des médicaments sur les cellules en conditions d'écoulement. La visualisation du montage est essentielle, car plusieurs des étapes sont difficiles à maîtriser uniquement en lisant un protocole. Je vais donner des instructions étape par étape pour configurer la chambre à écoulement et le circuit d'écoulement couramment utilisés dans le laboratoire du Dr Ock Next afin de monter le circuit d'écoulement.

Commencez par fixer un segment de 36 pouces de tube rigide à l'une des extrémités d'un amortisseur de pulsation, puis l'autre extrémité. Fixez un segment de 18 pouces de tube souple. Placez un raccord mâle de type « lure » de 1/8 de pouce à l'extrémité du segment de tube souple de 18 pouces.

Connecter l'appât mâle à un raccord femelle de un huitième de pouce. Fixer l'appât femelle à un nouveau segment de 18 pouces de tube souple. Percer trois trous dans le couvercle d'un bécher en verre de 250 millilitres.

Pour adapter le tube, insérez un segment de 1,5 pouce de tube souple dans un orifice, servant de ventilation d'air. Passez les extrémités libres des tubes rigide et souple à travers les deux autres orifices du bouchon et à l'intérieur du flacon en verre de 250 millilitres, qui servira de réservoir.

Veillez à ce que le tube rigide atteigne le fond du réservoir. Le maintien de la stérilité tout au long de la mise en place du circuit est crucial pour la réussite de cette procédure. Par conséquent, toutes les pièces doivent être stérilisées et vous devez porter des gants stériles pendant toute la durée de l'opération.

En plus des pièces assemblées, ces pièces doivent être stérilisées. Une chambre d'écoulement complète, trois segments de deux pouces de tuyau souple, un raccord mâle et un raccord femelle, un adaptateur de raccordement d'un huitième de pouce, quatre vis à tête plate d'un demi-pouce, 6 5 16 pouces, huit vis à tête plate de 30 secondes. Pouce de pistes par pouce, une paire de pinces, une lame de verre et deux serviettes stérilisées à la vapeur.

Stérilisation en autoclave à 121 degrés Celsius pendant 60 minutes. Placer le circuit d'écoulement, la chambre d'écoulement, les quatre robinets téflonnés quatre voies un par un, le robinet et toutes les pièces stérilisées sur ce champ stérile. En portant des gants stériles, relier les deux robinets téflonnés quatre voies.

Mettre les bouchons sur les orifices d'échantillonnage ouverts. Détacher les raccords mâles et femelles reliant les deux segments de tubulure souple du circuit de flux et insérer les robinets à trois voies connectés. Fixer la tubulure souple insérée dans le réservoir à une seringue de 30 millilitres et retirer le piston de la seringue.

Remplissez la bouteille avec 125 millilitres de milieu EPC. Rebranchez le tube souple au robinet. Placez un filtre stérile pour seringue dans l’orifice de ventilation.

Transférez à présent le circuit d'écoulement dans une enceinte d'incubation humidifiée à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone. Serrez le tube rigide dans la tête de pompe à rouleaux Master Flex indiquée pour une utilisation avec ce type de tube Palmer en caoutchouc. Veillez à ce que le tube ne chevauche pas les rails de fixation de la pompe à rouleaux.

Marquez le tube à l'endroit où il sort de la tête de la pompe, des deux côtés, à l'aide d'un stylo marqueur. Après vous être assuré que tous les robinets sont fermés en direction des orifices d'échantillonnage et ouverts le long du circuit d'écoulement, mettez la pompe en marche. Vérifiez le sens de l'écoulement.

Le PERFUSE huit doit s'écouler du réservoir en verre à travers le tube rigide jusqu'au dispositif d'atténuation des pulsations. Pour l'assemblage de la chambre d'écoulement, utilisez des gants stériles pour relier un segment de tube souple de deux pouces à un raccord femelle de un huitième de pouce. Reliez un autre segment de tube souple de deux pouces à un raccord mâle de un huitième de pouce.

Relier le tube souple de deux pouces muni d'un embout femelle à l'orifice d'entrée et le tube souple de deux pouces muni d'un embout mâle à l'orifice de sortie. Fixer des robinets en croix à chacun de ces embouts. Connecter le morceau restant de tube souple de deux pouces au raccord latéral provenant du piège à bulles et fixer un robinet unidirectionnel à l'aide de pinces stériles.

Retirer la lame ensemencée du récipient de culture cellulaire et la placer dans l'empreinte située sur la plaque inférieure de la chambre à écoulement. S'assurer que la lame est placée côté cellules vers le haut, puis ajouter à l’aide d’une seringue ou d’une pipette 10 millilitres de milieu EPC tiède sur la lame contenant les cellules. Laisser le milieu recouvrir la lame dans la chambre à écoulement, sans faire déborder le milieu par-dessus le joint torique situé sur la plaque inférieure.

Placer la plaque supérieure de la chambre d'écoulement sur la plaque inférieure en alignant les trous de vis. Maintenir les deux plaques parallèles afin de ne pas introduire de bulles d'air dans la chambre en vissant les plaques ensemble. À l'aide d'un tournevis automatique fonctionnant sur batterie, débarrasser le piège à bulles d'entrée en ouvrant le robinet unidirectionnel fixé au port du piège à bulles du côté d'entrée.

Utilisez une seringue de 10 millilitres pour rincer doucement le tube d'entrée avec le milieu EPC, puis fermez ce robinet et mettez-y un bouchon. Dégazez maintenant le canal de la chambre en ouvrant le robinet tétra-voie du port de sortie et en rinçant doucement le milieu EPC à travers la chambre d'écoulement. Utilisant à nouveau une seringue de 10 millilitres, mettez un bouchon sur toutes les connexions du robinet tétra-voie et fermez-les.

Transférez la chambre d'écoulement dans l'incubateur humidifié avec le circuit d'écoulement assemblé. Arrêtez la pompe du circuit d'écoulement pour fermer le circuit. Fermez les robinets dans le sens de l'écoulement afin d'éviter toute fuite.

Connectez la chambre d'écoulement au circuit de flux. Une fois la chambre d'écoulement raccordée au circuit de flux, ouvrez les robinets en T dans le sens de l'écoulement. Réactivez la pompe de flux et assurez-vous que le PERFUSE eight s'écoule dans le bon sens. Réglez le débit au niveau de contrainte de cisaillement souhaité.

Pendant l'expérience d'écoulement, la chambre d'écoulement peut être retirée du circuit pour observer les cellules par microscopie optique ou fluorescente. Pour ce faire, déconnectez la chambre d'écoulement du circuit d'écoulement au niveau des raccords du robinet à trois voies. Pour recueillir le liquide perfusé, prélevez huit échantillons destinés à l'analyse.

Tout d'abord, arrêtez la pompe et fermez le robinet d'arrêt situé le plus près de l'atténuateur de pulsation. Retirez son capuchon de protection en le plaçant à l'envers afin d'éviter toute contamination. Insérez une petite seringue dans le port d'échantillonnage.

Fermer le robinet en direction de la chambre d'écoulement, tout en maintenant le port d'échantillonnage et le circuit orientés vers l'amortisseur de pulsation ouverts. Prélever la quantité souhaitée d'échantillon à partir du circuit, puis fermer le robinet en direction du port d'échantillonnage avant de retirer la seringue. Conserver l'échantillon abondant n° huit dans un flacon étiqueté et congeler à moins 80 degrés Celsius.

Refermez le port d'échantillonnage et assurez-vous que tous les robinets sont ouverts avant de commencer l'écoulement. Grâce à cette méthode, des cellules progénitrices endothéliales dérivées du sang humain peuvent être ensemencées sur des lames de titane en moins de 15 minutes et adhèrent sous des forces de cisaillement physiologiques. Comme illustré sur cette figure, les CPE s'étalent sous l'effet de l'écoulement, passant d'environ 210 micromètres carrés juste après l'ensemencement à environ 657 micromètres carrés après trois heures, puis à environ 1 152 micromètres carrés après 48 heures de contrainte de cisaillement fluide de 15 dines par centimètre carré.

Cette image au microscope optique illustre l'orientation aléatoire des cellules progénitrices endothéliales humaines. Après une période d'adhérence statique de six heures suivant trois heures d'écoulement à 100 dynes par centimètre carré, les cellules se sont étalées mais conservent une orientation aléatoire. Après 48 heures de contrainte de cisaillement fluide à 100 dynes par centimètre carré, les CPE sont alignées et orientées dans le sens de l'écoulement.

Ici, les CEP ont été marquées avec le CTO et les noyaux cellulaires colorés avec l'herx avant la mort par flux. À titre de comparaison, cette image montre des CEP porcines sur des lames de titane alignées selon la direction du flux. Après 48 heures de flux et une exposition à une contrainte de cisaillement de 15 dines par centimètre carré, les contours cellulaires ont été colorés avec une coloration anti-PCAM et les noyaux avec une coloration nucléique au cytoxine.

Cette méthode permet également d'obtenir des échantillons du PERFUSE huit à des points temporels prédéterminés pour l'analyse et/ou la quantification des métabolites cellulaires sécrétés. On montre ici un exemple de production de nitrite au cours d'une expérience d'écoulement de 48 heures avec des CEP porcines. Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel de maintenir l'asepsie tout au long du processus.

En outre, il est important de prendre les mesures nécessaires afin de réduire le nombre de bulles d'air dans la chambre d'écoulement avant le début de l'écoulement continu, car elles pourraient détacher les cellules. Nous recommandons également de vérifier chaque raccordement individuel de la chambre d'écoulement et du circuit avant la perfusion afin d'éviter toute fuite de PERFUSE eight pendant une expérience. Cette chambre est conçue avec des joints toriques intégrés qui permettent une opposition complète des plaques supérieure et inférieure et assurent une étanchéité hermétique sans nécessiter de pompes à vide.

Cette fonctionnalité assure également une hauteur constante de la chambre entre les expériences et élimine le besoin de joints en caoutchouc ou de réglages. Notre chambre d'écoulement utilise des lames de microscope standardisées. Par conséquent, un grand nombre de cellules est disponible pour des expériences ultérieures.

Par exemple, l'ARN et l'ADN provenant de cellules après un écoulement peuvent être évalués pour la synthèse des protéines ou l'expression génique. Notre conception de circuit permet la collecte de huit échantillons par perfusion pour l'analyse et la quantification de métabolites cellulaires tels que le nitrite, un métabolite oxydatif primaire de l'oxyde nitrique, qui est sécrété par les cellules sous contrainte de cisaillement fluide. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'assembler notre chambre à écoulement et le circuit d'écoulement stérile afin de soumettre des cellules adhérentes à une contrainte de cisaillement fluide.