Visualisation des Caenorhabditis elegans Utilisation du colorant lipophile Vital, Dii

L'objectif général de cette procédure est de visualiser la cuticule chez des nématodes vivants transparents à l'aide du colorant lipophile rouge fluorescent dye eye. Cela est réalisé en préparant une population de nématodes pour la coloration. Ensuite, le colorant dye eye dilué est ajouté à la population, puis celle-ci est laissée à incuber.

Ensuite, les animaux sont récupérés à partir de la solution de coloration. L'imagerie en fluorescence de l'exosquelette coloré au Dai révèle des détails de surface, notamment les structures reproductrices oculaires d'Ailey et d'Ann ainsi que d'autres caractéristiques morphologiques externes. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes de visualisation de l'exosquelette chez cet organisme transparent, telles que l'imagerie directe, la fluorescence, l'expression de transgènes, la coloration immuno-histochimique, la microscopie électronique et l'agglutinine de germe de blé marquée, réside dans sa facilité d'exécution, sa rapidité relative, son faible coût et sa capacité à fournir une résolution remarquable des structures cuticulaires chez des animaux vivants.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions fondamentales dans de nombreux domaines utilisant le système modèle *Caenorhabditis elegans* et son cuticule, tels que la sécrétion cellulaire et l'organisation du cuticule, le développement des cellules épidermiques, les voies génétiques hétérochroniques, l'immunité innée, le développement de traits morphologiques et l'évolution des nématodes. La procédure sera démontrée par Robbie Schultz, un étudiant diplômant de mon laboratoire. Lorsque vous travaillez avec D Eye, gardez à l'esprit qu'il est sensible à la lumière.

Protégez toujours l'œil D de la lumière en l'enveloppant dans du papier d'aluminium. Portez également des gants et une blouse de laboratoire car le DMF est toxique et le DAI est un car. Le cyanure Dai est très puissant.

Une dilution de travail à concentration standard correspond à 30 microgrammes par millilitre de DII dans du M nine, et une seule population nécessite 400 microlitres de cette dilution de travail. Commencez avec une plaque de 60 millimètres contenant des nématodes non contaminés. Lavez les animaux de la plaque avec 1,5 millilitre de Triton X 100 à 0,5 %.

Dans du tampon M neuf, faire tourner doucement le liquide en mouvements circulaires afin de détacher tous les animaux larvaires et adultes, puis transférer le lavage dans un tube de 1,5 millilitre. Centrifuger immédiatement les animaux à 2000 tr/min pendant 30 secondes pour les regrouper au fond du tube. Éliminer le surnageant en laissant aussi peu que possible, sans déranger les animaux.

Sois prudent, pas avide. Lavez les animaux avec un millilitre de M neuf. Centrifugez et retirez le surnageant.

Répétez le lavage. Centrifugez à nouveau et retirez le surnageant. Ensuite, ajoutez 400 microlitres de Dai à 30 microgrammes par millilitre dans M9 au tube.

Vortexez brièvement le tube pour resuspendre les animaux. Ensuite, agitez le tube à 20 degrés Celsius en position horizontale pendant trois à seize heures à 350 tr/min dans un environnement protégé de la lumière. La durée de ces dernières étapes est importante.

Étape préalable, le Triton X doit être lavé afin d'éliminer les lipides que le dai fixe. Deuxièmement, les animaux doivent être colorés dans la solution de colorant « eye » suffisamment longtemps pour permettre une coloration uniforme de la cuticule. Un peu plus tard, les animaux doivent être laissés en récupération sur la nourriture suffisamment longtemps pour éliminer le colorant « eye » non lié.

À la fin de la coloration, centrifuger les animaux et éliminer la solution de colorant. Laver les animaux avec un millilitre de milieu M neuf. Pour éliminer le colorant non lié, centrifuger les animaux et retirer le surnageant.

Résuspendre les animaux dans 400 microlitres de tampon M neuf et les verser sur une portion sans bactéries d'une microplaque NGM. Ensemencée avec E. coli OP50, laisser les animaux récupérer à l'obscurité pendant au moins 30 minutes, mais pas plus d'un jour, car la fluorescence du colorant s'atténue pendant le temps de récupération. Les animaux doivent ramper hors du liquide de coloration et vers la nourriture.

Ces animaux sont plus faciles à imager car ils présentent une fluorescence de fond moins importante provenant du colorant libre dans l’œil. Commencez par préparer un tampon d’agarose sur une lame afin d’assurer une épaisseur uniforme du tampon, à l’aide de deux entretoises.

Un espaceur est fabriqué en superposant deux morceaux de ruban adhésif de laboratoire sur une lame de verre. Les espaceurs peuvent être utilisés indéfiniment. Ensuite, placez une lame de verre propre dans le sens de la longueur entre deux lames espaceurs, puis ajoutez environ 150 microlitres de gélose quatre fondue à l’aide d’une pipette.

Au centre de la lame en verre propre. Recouvrir rapidement l'AER fondu avec une lame supplémentaire placée perpendiculairement sur l'AER et les deux entretoises afin de former un coussin d'agar. Faire glisser délicatement la lame de couverture, en maintenant le coussin centré sur la partie supérieure de la lame de montage.

Prélève maintenant cinq microlitres d'anesthésique pour nématodes sur la lame, place huit à douze animaux dans l'anesthésique et recouvre délicatement avec une lamelle de microscope. Observe les animaux à l'aide d'un microscope composé ou confocal équipé d'un objectif d'au moins 40 x et d'un filtre trissy ou d'un autre filtre compatible. Le maximum d'excitation fluorescente du colorant eye est de 549 nanomètres et son maximum d'émission est de 565 nanomètres.

Pour les échantillons fixés, l'imagerie constitue la partie la plus délicate de ce protocole. Nous montrons comment monter les animaux pour l'imagerie, mais vous devez être correctement formé à l'utilisation du microscope composé ou confocal que vous allez utiliser. Nous avons constaté qu'il est préférable d'utiliser un objectif d'au moins 60 x de grossissement afin de bien distinguer les détails mis en évidence par la méthode de coloration.

Chacune des images de cette section a été prise à l'aide d'un objectif 63 x chez l'embryon postérieur de C. elegans. La surface de la cuticule présente des anneaux séparés annuellement par des sillons circonférentiels et, à certains stades, des crêtes longitudinales appelées ailey. Chacune des images de cette section a été prise avec un objectif 63 x chez l'embryon postérieur de C. elegans.

La surface de la cuticule présente des anneaux séparés par des sillons circonférentiels et, à certains stades, des crêtes longitudinales appelées aley. Chaque stade de développement possède des structures cuticulaires aux compositions et motifs distincts, et les crêtes ou sillons des aley et Aly se colorent de manière fluorescente, selon la composition de la surface.

Pendant toutes les étapes larvaires et adultes utilisant cette méthode de coloration par immersion, les animaux restent visibles jusqu'à un jour après la récupération. Des taches fluorescentes de fond sont parfois observées, mais pas de manière systématique. Il s'agit de la cuticule d'animaux adultes mutés présentant des défauts modérés d'organisation cuticulaire.

Les crêtes d'Ailey sont discontinues et supplémentaires. Les crêtes d'Ailey sont fusionnées et ramifiées ou bifurquées, un marqueur transgénique courant. Un allèle dominant roll six provoque une torsion de la cuticule, qui peut être observée au niveau de l'ailey et entraîner un dessin irrégulier des annuli.

Dai colore également d'autres structures du tégument externe, notamment le vulve de l'hermaphrodite adulte et la queue du mâle adulte, ainsi que le fanon ; dai peut aussi révéler des anomalies subtiles de la morphologie externe, comme cette queue fourchue, en cas de coloration insuffisante. Par exemple, une coloration de deux heures conduit à une coloration cuticulaire irrégulière, bien que les neurones exposés à l'environnement puissent être colorés. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures, sans compter l'observation microscopique, si elle est effectuée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment colorer Caenorhabditis elegans avec le colorant DAPI afin d'observer la cuticule et d'autres structures morphologiques externes.