Comparaison quantitative des Cis-Regulatory Element (CRE) Activités dans transgéniques Drosophila melanogaster

L'objectif général de cette procédure est de mesurer quantitativement les activités régulatrices des éléments régulateurs en *cis* ou CRE actifs durant le développement métamorphique de *Drosophila melanogaster*. Commencez par des méthodes d'intégration site-spécifique afin de générer des lignées de CRE intégrés transgéniquement comme transgènes rapporteurs. À l’aide d’un microscope stéréo, obtenez des spécimens transgéniques au stade de développement approprié.

Retirez les spécimens du pub externe et montez-les sur une lame de microscope en verre. Faites ensuite glisser l'échantillon pour enregistrer le niveau et le motif d'expression de la protéine rapporteur fluorescente dans des échantillons entiers par analyse microscopique confocale. Enfin, quantifiez le niveau d'expression de la protéine rapporteur fluorescente pour les images confocales enregistrées à l'aide de l'outil logiciel ImageJ.

Ces résultats attribuent un niveau d'activité régulatoire génique à l'élément régulateur auxiliaire et facilitent des études comparatives supplémentaires sur l'expression génique portant sur des versions modifiées des CRE. Cette procédure peut aider à répondre à des questions clés et intéresse particulièrement la régulation génique ainsi que la manière dont cette régulation est encodée. L'ADN revêt une importance particulière en biologie du développement et en biologie évolutive.

Cette procédure a été mise au point pour fournir des informations sur les éléments régulateurs *cis* qui fonctionnent pendant le développement métamorphique de *Drosophila melanogaster*. En principe, toutefois, elle peut être appliquée à des éléments régulateurs *cis* qui fonctionnent pendant d'autres stades de développement et chez d'autres espèces de mouches à fruits, voire chez d'autres organismes modèles. Afin d'agrandir les lignées transgéniques, préparez deux flacons contenant plusieurs mouches mâles et femelles en les alternant tous les deux jours.

Transférez les mouches d’un des flacons dans un nouveau flacon. Répétez cette opération pendant une semaine. Au bout de deux semaines, vérifiez que les mouches transgéniques se trouvent à différents stades de développement, allant de la larve à l’adulte.

Commencez le classement des spécimens à la fin du troisième stade larvaire, lorsque le RE est formé. Notez que le spécimen est non mobile. Le RE est blanc ramolli et les sphériques présentent une spécification détournée, ce qui caractérise ce point temporel.

Au stade zéro JAPF. Différencier les mâles des femelles par la présence de gonades situées bilatéralement près du milieu du corps, qui apparaissent sous forme de cercles translucides, en fonction de la longueur de la métamorphose. Au stade zéro JAPF, transférer les spécimens dans un nouveau flacon à l’aide d’un pinceau humidifié.

Ajoutez un morceau de papier essuie-tout et humidifiez-le avec de l'eau pour éviter que les spécimens ne s'assèchent. Incubez ensuite le flacon à 25 degrés Celsius jusqu'au stade HAPF souhaité. En alternative, classez les spécimens en les triant selon la présence et la position de plusieurs marqueurs morphologiques, comme décrit dans le texte accompagnant.

Avec du ruban adhésif de laboratoire, fixez un morceau de ruban d'emballage sur une planche de dissection, côté collant vers le haut. Humidifiez un pinceau et appliquez de l'humidité sur les spécimens à l'aide du pinceau. Transférez les spécimens sur un essuie-tout Kim.

Transférez les spécimens sur le ruban adhésif et fixez-les avec la face dorsale vers le haut. Laissez les spécimens sécher pendant 15 minutes. Ouvrez progressivement l’ER à l’aide de pinces.

Commencez par l'extrémité antérieure ou perm et progressez vers l'extrémité postérieure. Ensuite, transférez le pui dans une goutte d'huile visqueuse sur une lame de microscope et examinez l'échantillon au microscope pour les spécimens en montage complet. Utilisez soit l'objectif Forex soit l'objectif 10 x pour mettre l'échantillon au point.

À l’aide du logiciel du microscope confocal, ajustez la longueur d’onde d’excitation pour la protéine fluorescente souhaitée afin d’éviter la photodégradation. Commencez avec une intensité laser comprise entre 5 et 10 %. Si le signal est insuffisant, augmentez l’intensité selon les besoins afin d’améliorer le rapport signal sur bruit. Pour les images confocales, activez les paramètres logiciels permettant de faire la moyenne des mesures de pixels à partir de balayages répétés, tels que la moyenne de Kalman, pour des comparaisons quantitatives de l’activité du CRE, en utilisant la coupe C là où la fluorescence apparaît la plus intense.

Passer à une table de correspondance d'avertissement de saturation et régler le gain et le décalage de tension du canal sur des valeurs où peu de pixels sont saturés. Si nécessaire, ajuster l'ouverture confocale. Une fois les paramètres optimaux déterminés, effectuer la numérisation ZS pour obtenir une série d'images le long de l'axe Z.

Lorsque le balayage est terminé, convertir la pile d'images en une projection et enregistrer ce fichier image au format TIF. Pour une comparaison quantitative des activités de CRE, utiliser les mêmes paramètres de microscopie confocale pour tous les échantillons répliqués et toutes les lignées de transgènes rapporteurs. Pour l'expérience avec le programme ImageJ, ouvrir une image TIFF à évaluer.

Cliquez sur le bouton de sélection à main levée et délimitez la zone de l'échantillon où une quantification est souhaitée. Pour obtenir une statistique de valeur de pixel, cliquez sur l'onglet Analyser, puis sélectionnez Mesurer. Enregistrez la valeur moyenne de pixel indiquée dans la fenêtre des résultats.

Collectez également une deuxième valeur moyenne de pixel à partir d'une région de fond où le CRE n'est pas actif. Pour obtenir une valeur moyenne de pixel ajustée, continuez à générer des statistiques sur les valeurs de pixel pour des spécimens répliqués. Ensuite, à partir des valeurs moyennes de pixel ajustées des répliques, déterminez l'activité régulatoire moyenne pour un CRE A et calculez également l'erreur type de la moyenne.

Cette expérience utilise l'intensité du phénotype oculaire de couleur blanche sauvée pour rendre des lignées transgéniques homozygotes. Un fond génétique muté du gène white, contenant une séquence cible A TTP, est utilisé pour l'intégration spécifique du transgène au niveau d'un site donné. Les individus transgéniques, hémizygotes ou homozygotes pour le vecteur intégré, sont distingués selon l'intensité du phénotype de couleur des yeux sauvée, qui dépend du nombre de copies du gène mini white intégré.

Des lignées homozygotes sont ensuite établies en croisant des mouches mâles et femelles présentant le phénotype de couleur d'œil le plus foncé. Des marqueurs morphologiques sont utilisés pour déterminer le stade métamorphique de drosophile pendant la métamorphose, du stade larvaire à celui de la mouche adulte. L'échantillon passe par une série de morphologies stéréotypées qui permettent de déterminer le sexe et d'estimer approximativement le stade de développement. Ici.

Une version sauvage d’un ÉCR désignée sous le nom d’élément dimorphe induit des niveaux élevés d’expression du gène rapporteur EGFP dans le segment abdominal ASIC de la femelle puy. Une séquence de 13 paires de bases au sein de cet ÉCR s’est révélée être un site de fixation du facteur de transcription DSX, et l’importance in vivo de cette séquence est démontrée en quantifiant l’activité régulatrice de l’ÉCR lorsque ce site de liaison est muté. Des analyses quantitatives indiquent que la mutation de ce site DSX réduit l’activité régulatrice à 28 ± 3 % de l’expression de type sauvage dans le contexte du site d’insertion du transgène utilisé ici.

Des comparaisons similaires évaluent les activités régulatrices pour des allèles CRE intraspécifiques ou entre des CRE autologues provenant d'espèces distinctes, par exemple, par rapport aux niveaux d'EGFP dans le segment femelle. Un six entraîné par les CRE autologues de la souche D Melin gastric Canin S pour les espèces D stimulants et D willi possède des activités régulatrices égales à 75 ± 4 % et 0 ± 0 %, respectivement. Des méthodes de procédure comme l'interférence ARN peuvent être utilisées avec des gènes de facteurs de transcription afin de répondre à des questions supplémentaires sur la manière dont ces gènes de facteurs de transcription interagissent avec les éléments régulateurs CYS.

Cela serait indiqué par l'augmentation et la diminution de l'expression de la protéine rapporteur fluorescente, dirigée par des éléments régulateurs CIS après son développement. Cette procédure a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la régulation génique pour explorer l'importance fonctionnelle que possèdent les motifs des éléments régulateurs *cis* et les mutations évolutives sur l'expression des gènes.