Formulation de nanoparticules polymériques dibloc par la technique nanoprécipitation

L'objectif général de cette procédure est de synthétiser des nanoparticules polymériques en utilisant une méthode de nanoprécipitation. Cela est réalisé en effectuant d'abord une réaction E-D-C-N-H-S afin de produire un copolymère A-P-L-G-A PEG. Le copolymère PLGA PEG est ensuite utilisé pour générer des nanoparticules, encapsulant ainsi le médicament ou la charge utile d'intérêt par nanoprécipitation.

À ce stade, une caractérisation biophysique de base, incluant la taille, la charge de surface et l'efficacité de chargement en médicament, peut être réalisée par diffusion dynamique de la lumière, microscopie électronique en transmission ou HPLC. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie des tumeurs, car les nanoparticules peuvent délivrer des thérapeutiques anticancéreuses peu solubles, qui pourraient s'avérer plus efficaces que les traitements actuels. Bien que cette méthode puisse fournir des informations utiles pour le traitement du cancer.

Il peut également être utilisé pour étudier d'autres systèmes, tels que le trafic cellulaire. Les nanoparticules peuvent être conjuguées à un ligand ciblant et visualisées in vivo ou in vitro grâce à l'utilisation d'un agent d'imagerie illustrant la technique. Aujourd'hui seront présents deux techniciens de notre laboratoire, Rohit Sukumar et Natalie Cummings, pour commencer la synthèse du copolymère PLGA PEG en dissolvant le PLGA carboxylate dans l'acétonitrile à une concentration de cinq millimolaire sous agitation douce.

Ensuite, ajouter suffisamment de NHS et d'EDC pour obtenir des concentrations de 25 millimolaire, assurant un excès stœchiométrique de cinq fois par rapport au PLGA, puis agiter doucement la solution pendant environ une heure afin de permettre la conversion du carboxylate de PLGA en PGA-NHS. Après une heure, précipiter le produit réactionnel PGA-NHS en ajoutant la solution de lavage, le méthanol, à un volume d'environ dix fois supérieur, en excès par rapport à la solution. Centrifuger la solution à 2000 × g pour former un culot contenant le PGA-NHS. Après centrifugation, éliminer le surnageant afin d'éliminer les traces d'EDC et de NHS. Cette procédure de lavage avec du méthanol est répétée au moins trois fois.

Une fois le lavage terminé, séchez le culot de P-L-G-A-N-H-S sous vide pendant 30 minutes afin d'éliminer toute trace de solution de lavage. Redissolvez ensuite le culot de P-L-G-A-N-H-S dans de l'acétonitrile à la même concentration que celle initialement utilisée pour dissoudre le PLGA.

Une fois dissous, ajouter le PEG hétéro-bifonctionnel à la solution de PLGA. Ajouter une concentration de cinq millimolaire.

Incuber la solution du mélange pendant 24 heures sous agitation constante après 24 heures. Précipiter le produit de réaction du copolymère bloc PLGA PEG en ajoutant du méthanol en excès. Effectuer le lavage et la centrifugation trois fois supplémentaires afin d'éliminer tout l'excès de PEG non réactif.

Comme étape finale de la synthèse, sécher le copolymère bloc PLGA PEG ; la précipitation de nanoparticules commence par la dissolution du copolymère bloc PLGA PEG et du médicament à encapsuler dans un solvant A-P-L-G-A. Le choix du solvant est crucial, car il influence les propriétés de la nanoparticule. Ajouter ensuite, goutte à goutte, le mélange polymère-médicament à trois à dix volumes d'eau sous agitation, afin d'obtenir une concentration finale en polymère d'environ trois milligrammes par millilitre. Goutte à goutte.

L'ajout de la solution organique à la phase aqueuse est essentiel pour former des nanoparticules de la taille appropriée. Poursuivre l'agitation pendant deux heures sous pression réduite afin de permettre la formation des nanoparticules par auto-assemblage et d'éliminer les traces de solvant organique. Après deux heures d'agitation.

Concentrez les nanoparticules par centrifugation à 2 700 ×g pendant 10 minutes à l’aide d’un filtre Amon. Ensuite, lavez les nanoparticules avec du PBS pour éliminer tout médicament non piégé, puis procédez à une nouvelle centrifugation. Enfin, reconstituez les nanoparticules dans du PBS à ce stade.

Une caractérisation biophysique de base, incluant la taille, la charge de surface et l'efficacité de chargement en médicament, peut être réalisée afin de mieux comprendre les propriétés des nanoparticules. Les nanoparticules peuvent être conservées comme décrit dans le protocole écrit ; pour caractériser les nanoparticules de PLGA PEG, une microscopie électronique en transmission a été utilisée afin de confirmer la taille, la distribution et la structure des nanoparticules. La taille des particules se situe généralement dans la gamme du nanomètre.

Des tailles de particules importantes avec des distributions de taille hétérogènes pourraient indiquer soit une erreur dans la réaction de conjugaison, soit la nécessité d'optimiser la méthode de nanoprécipitation. On présente ici une étude cinétique de libération du médicament, dans laquelle l'efficacité de chargement et la libération du paclitaxel ont été quantifiées par HPLC standard. Des quantités fixes connues de nanoparticules ont été dialysées à des intervalles de temps réguliers.

Le contenu de l'unité de dialyse a été récupéré et un volume égal de solvant organique a été ajouté pour dissoudre les nanoparticules. Une chromatographie en phase liquide haute performance (HPLC) a ensuite été réalisée sur ces échantillons. Pour quantifier la teneur en paclitaxel, une fois la technique maîtrisée, cette méthode de nanoprécipitation peut être correctement réalisée en trois heures.

Veillez à toujours ajouter lentement la phase organique à la phase aqueuse lors de l'exécution de cette technique, afin d'éviter la formation de particules de grande taille après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en cancérologie dans le domaine de la nanomédecine, leur permettant d'explorer l'utilisation de médicaments peu solubles, auparavant jugés trop toxiques chez les patients atteints de cancer, après cette procédure. D'autres méthodes, telles que des études d'efficacité in vivo ou des études d'imagerie, peuvent être réalisées pour répondre à des questions telles que l'efficacité des médicaments peu solubles lorsque la toxicité systémique n'est plus un problème, ou encore si les ligands de ciblage dirigent correctement les nanoparticules vers leur destination.