Surveillance clivées activité caspase-3 et l'apoptose des cellules immortalisées oligodendrocytaires utilisant imagerie des cellules vivantes et de Cleaveable fluorogénique-dye substrats suivants dépolarisation de la membrane de potassium induite par

Cette procédure permet de surveiller en temps réel la mort cellulaire des cellules gliales induite par l'oligo DDR. Cela est réalisé en premier lieu par la culture des cellules, puis par la préparation des cellules pour l'imagerie de cellules vivantes. L'étape suivante consiste à appliquer un traitement aux cellules et à en observer les effets par microscopie de fluorescence.

La dernière étape consiste à effectuer l'analyse des données. En définitive, les résultats montrent les taux de mort cellulaire dans une population cellulaire après un traitement ou un stimulus, en surveillant la fluorescence nucléaire provenant d'un colorant fluoré activé par la caspase. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la coloration immunohistochimique réside dans la capacité à recueillir simultanément plusieurs points temporels.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie cellulaire, telles que les réponses aux traitements pharmacologiques, aux réactifs et à diverses interventions. Désormais, cette méthode permet d'obtenir des informations sur la mort cellulaire dans les cultures cellulaires. Elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme les tissus ex vivo et organotypiques, notamment les tranches de cerveau.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés lorsqu'elles s'adapteront à la manipulation de tissus vivants plutôt que de tissus fixés. Une démonstration visuelle de cette technique est importante, car de nombreuses étapes sont nécessaires pour préparer des échantillons de cellules vivantes, contrairement aux tissus fixés. Commencez par décongeler les cellules gliales oligodendrocytaires immortelles N 19 dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius pendant que les cellules décongèlent.

Ajoutez sept millilitres de DMEM à forte concentration en glucose supplémenté avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine dans une boîte de culture de 10 centimètres. Ensuite, ajoutez la suspension cellulaire goutte à goutte dans la plaque et agitez doucement la boîte de Pétri pour répartir les cellules uniformément. Incubez les cellules à 34 degrés Celsius dans un incubateur à 5 cent de dioxyde de carbone pendant quatre heures après quatre heures.

Aspirez le milieu des plaques pour éliminer tout DMSO. Cryoprotectant résiduel. Remplacez par sept millilitres de milieu frais après quatre à sept jours de croissance. Lorsque les cellules ont atteint une confluence de 70 à 80 %, aspirez le milieu et ajoutez un millilitre de goutte à goutte sur la couche cellulaire à l’aide d’une pipette, puis incubez à température ambiante pendant cinq minutes.

Ensuite, récoltez les cellules pour les semer dans une plaque de culture tissulaire de 10 centimètres avec les cellules récoltées à une densité de 0,1 fois 10 puissance 6 cellules par millilitre, puis placez cette plaque dans l'incubateur de culture tissulaire. Après un autre passage, les cellules peuvent être mises en culture pour des expériences d'imagerie de cellules vivantes. Pour ce faire, récoltez les cellules comme précédemment, puis prélèvez 30 microlitres de la suspension cellulaire et comptez les cellules à l'aide d'un hémo-cytomètre.

Ensuite, utilisez des pinces stériles pour placer des lamelles en verre non revêtues. Dans les puits d'une plaque de six puits, ajoutez les cellules dans chaque puits à une densité de 0,1 × 10⁶ cellules par millilitre. Dans deux millilitres de milieu DMEM à haute teneur en glucose, sans phénol, supplémenté avec 10 % FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine, laissez les cellules croître toute la nuit à 34 °C et 5 % CO₂ avant la transfection.

Le lendemain, mélanger 100 microlitres de milieu sans sérum avec 0,5 à quatre microgrammes d'ADN plasmidique purifié et quatre microlitres de FU gene hd. Vortexer doucement le mélange deux fois, puis laisser le complexe d'ADN s'associer à température ambiante pendant cinq minutes. Une fois le temps d'incubation écoulé, ajouter directement le mélange d'ADN FU gene HD aux cellules en culture.

Inclinez délicatement la plaque pour mélanger. Incubez ensuite les cellules pendant 48 heures supplémentaires à 34 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avant le traitement ou l'expérimentation. Allumez d'abord la boîte de commande de l'instrument de culture cellulaire en temps réel LCI Cham.

Cela doit être fait trois heures avant le début de l'expérience afin de garantir un réchauffement complet de la platine. Au minimum, la boîte de commande doit être allumée une heure avant le début de l'expérience. Ensuite, en travaillant dans une hotte à flux laminaire, vaporisez la chambre de culture magnétique de type LCI Cham light et la pince avec de l'éthanol à 70 % et laissez-les sécher pendant cinq minutes.

Retirer les cellules de l'incubateur et les examiner au microscope pour confirmer qu'elles sont en bonne santé. Les cellules doivent apparaître durantes et bien étalées sur le lamelle de verre, avec de nombreux prolongements membranaires. Les cellules présentant un nombre réduit de prolongements ou un noyau de forme irrégulière sont probablement stressées suite à la transfection et ne conviennent pas pour des expériences ultérieures réalisées sous hotte à flux laminaire.

Inclinez la plaque à six puits et retirez le lamelle avec des pinces. Placez rapidement le lamelle, côté cellules vers le haut, dans le fond de la chambre. Veillez à ce que le lamelle ne sèche pas.

Ensuite, fixez le corps principal magnétique de la chambre de culture et ajoutez 500 microlitres de milieu provenant de la plaque de 6 puits d'origine sur la partie supérieure du coverslip. Le réemploi du milieu diminue le niveau de stress subi par les cellules en raison des changements environnementaux et peut également s'avérer utile pour évaluer les facteurs sécrétés extracellulaires. Une fois le milieu ajouté, placez le couvercle en verre sur la chambre de culture et utilisez une mèche en papier Kim imprégnée à 70 % pour éliminer tout matériau résiduel susceptible d'interférer avec la microscopie, situé sur la face inférieure du coverslip.

Placer la chambre de culture dans l’incubateur à 34 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Cette étape permettra de s'assurer que la chambre elle-même atteint 34 degrés, réduisant ainsi les déplacements du coverslip. À mesure que le métal s'échauffe, il est nécessaire d'effectuer les étapes suivantes avec un éclairage ambiant aussi faible que possible.

Tout d'abord, Thora avait précédemment préparé une éléqua de vue nucléaire à température ambiante. Ensuite, retirez la chambre de culture de l'incubateur et placez-la rapidement dans la chambre environnementale du microscope. Allumez le réservoir de dioxyde de carbone pré-mélangé à 5 % équipé d'un double régulateur.

Ensuite, utilisez l'objectif 10 fois avec la lampe du microscope réglée à environ 2,5 volts et un temps d'exposition de 240 millisecondes. Focalisez à l'aide de la microscopie en champ clair pour visualiser les cellules sur l'écran de l'ordinateur. Puis ajoutez une concentration de 80 millimolaire d'ions potassium ou d'un autre inducteur de l'apoptose aux cellules par un échange de milieu, en utilisant une perfusion lente et locale à l'aide d'une pompe péristaltique.

Le substrat nuke view 4 88 est stable en culture cellulaire pour des expériences d'une durée allant jusqu'à 36 heures. Il est donc possible de réaliser des expériences sur cette période. Commencez par configurer le microscope afin de visualiser la fluorescence des protéines fluorescentes rouge et verte.

Ensuite, cliquez sur le canal rouge pour afficher les cellules transfectées. Sélectionnez et enregistrez environ 12 images contenant plusieurs cellules transfectées, et sauvegardez ces points de la platine XY. Configurez le microscope pour acquérir des images en champ clair, canal rouge et canal vert, à ces positions enregistrées de la platine toutes les six minutes.

Après avoir collecté plusieurs points XY à partir d'expériences réalisées en double ou en triple, compilez les données provenant d'expériences distinctes effectuées à différents jours et procédez à l'analyse des données et aux tests statistiques comme décrit dans le protocole écrit, afin de comparer le ratio de cellules négatives pour CASP bay à celui des cellules positives pour CASP bay. Le substrat Nuke view 4 88 peut indiquer un taux accru d'apoptose dans des cultures cellulaires gliales oligo DDR N 19. Suite à un traitement avec une concentration élevée de potassium extracellulaire, ces images de base ont été acquises à l’aide d’un objectif 10 fois.

Les cellules N 19 ont été transfectées avec RFP et ont été soit traitées avec trois microlitres de nuke view, substrat 4 88 pour les cellules témoins, soit avec trois microlitres de nuke view, substrat 4 88 et 80 millimolaire de potassium. Ces images illustrent que le nombre de cellules apoptotiques augmente au fil du temps, trois, six et neuf heures après le traitement avec 80 millimolaire de potassium. Dans les conditions témoins, aucune quantité significative d'apoptose n'a été observée par rapport aux cultures traitées avec 80 millimolaire de potassium. Le signal vert de fond observé dans les conditions témoins indique les cellules qui entrent en apoptose sans l'ajout de potassium extracellulaire.

Un cours temporel de 12 heures est suffisant pour des études impliquant des lésions neurologiques. Après 12 heures, les cultures traitées au potassium montrent environ 45 % de mort cellulaire. Pratiquement aucune des cellules dans l'expérience témoin n'exhibe d'apoptose au point temporel de 12 heures. Bien que dans d'autres situations, les expériences puissent devoir être prolongées.

Ce graphique montre l'augmentation du nombre de cellules positives pour la caspase trois au cours des 12 heures de l'expérience. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure, et les données peuvent être collectées pendant la nuit si elle est correctement exécutée. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de rester constant entre les traitements en suivant cette méthode.

D'autres méthodes, telles que la coloration immunohistochimique, peuvent être utilisées pour examiner d'autres protéines en aval impliquées dans les voies étudiées. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des échantillons pour l'imagerie. Acquérir un jeu de données et analyser vos résultats.