Synthèse, l'Assemblée, et caractérisation des nanoparticules Monocouche protégées Films d'or pour Electrochimie monocouche de protéines

L'objectif général de l'expérience suivante est de synthétiser des nanoparticules d'or stabilisées par des groupements alkyles, appelées agrégats protégés par une monocouche ou MPC, puis d'assembler ces matériaux en films minces utilisés comme interface d'absorption pour l'électrochimie de monocouches de protéines azarines. Cette réalisation s'effectue d'abord en protégeant des colloïdes d'or par des ligands organiques afin de créer des nanoparticules d'or entourées par un film d'alcanpholate. Ensuite, les MPC sont ancrés sur des substrats d'or et de verre, puis assemblés en films minces multicouches reliés covalemment, dont la croissance est suivie par des mesures optiques et électrochimiques, ainsi que par microscopie en coupe transversale.

Ensuite, la protéine de transfert d'électrons azarine est absorbée à l'interface et une télémétrie cyclique en voûte est effectuée pour l'électrochimie de monocouche protéique. Les résultats montrent que les interfaces de films MPC créées par cette procédure permettent une analyse électrochimique plus optimisée des protéines adsorbées sur la base du film MPC, offrant une interface d'adsorption plus homogène et des cinétiques de transfert d'électrons rapides, sans dépendance classique à la distance. Le principal avantage de cette technique par rapport à l'électrochimie protéique traditionnelle est que les électrodes modifiées par des films de nanoparticules fournissent une interface d'absorption qui conduit à un comportement électrochimique plus idéal, mesuré par la photométrie cyclique.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la synthèse comporte des indices visuels importants, tandis que la construction et la caractérisation du film impliquent plusieurs étapes complexes et techniques analytiques. Les films NPC peuvent être assemblés sur des électrodes d'or modifiées ou sur des lames de verre en utilisant une méthode de trempage cyclique alternant des couches MPC et des molécules de liaison dile. Par conséquent, ces couches peuvent être suivies électrochimiquement ou optiquement jusqu'à une épaisseur de film souhaitée.

Pour synthétiser des agrégats d'or sous une hotte avec une ventilation appropriée, commencez par dissoudre 1,1 gramme de bromure de tétraoctyldécyldiméthylammonium dans 30 millilitres de toluène, puis dissolvez 0,38 gramme de borohydrure de sodium dans environ 20 millilitres d'eau ultra-purifiée de 18 mégohms et laissez refroidir sur glace pendant au moins 30 minutes. Ensuite, transférez quantitativement une solution aqueuse d'acide tétrachloroaurique dans la solution de bromure de tétraoctyldécyldiméthylammonium dans le toluène à l’aide de cinq millilitres supplémentaires d’eau ultra-purifiée. Afin de transférer la phase aqueuse contenant l’or vers la phase non aqueuse, bouchonnez légèrement le récipient et agitez vigoureusement pendant 30 minutes.

Ainsi, les phases aqueuse orangée brûlé et non aqueuse claire sont bien mélangées. Transférez les deux phases, aqueuse claire et non aqueuse orangée brûlé, dans une ampoule à décanter. Jetez la couche aqueuse et versez la couche non aqueuse dans un flacon propre.

Ajoutez C six et un rapport de deux pour un à la solution non aqueuse contenant de l'hydrogène tétrachloro ou du tétrachloraurate. Agitez pendant 30 minutes afin de former un polymère d'or(I), comme en témoigne un changement de couleur passant d'un orange rougeâtre à une solution jaune pâle, presque incolore. Transférez le mélange réactionnel dans un bain de glace isolé et refroidissez à zéro degré Celsius pendant au moins 30 minutes sous agitation. Ajoutez quantitativement et rapidement la solution refroidie de borohydrure de sodium au mélange réactionnel afin de réduire l'or(I) en or métallique en présence de cuisses.

Après ajout, une solution noire épaisse de groupements d'or à couche unique protégée, ou MPC, se forme instantanément. Laisser réagir toute la nuit sous agitation à zéro degré Celsius le jour suivant. Transférer le mélange réactionnel dans une ampoule à décanter.

Jetez la couche aqueuse dans un bécher de déchets et effectuez une évaporation sous vide rotatif. Évaporez la couche de toluène non aqueuse jusqu'à quasi-complète dessiccation, laissant un résidu noir épais dans le flacon. Précipitez les MPC en ajoutant de l'acétonitrile et laissez la solution reposer toute la nuit en utilisant un fritté de verre de porosité moyenne équipé de raccords en caoutchouc et un flacon latéral muni d'un aspirateur.

Recueillir les MPC par filtration sous vide et rincer avec une grande quantité d'acétonitrile. Après avoir assemblé électrochimiquement la cellule en sandwich, nettoyer le substrat en or en effectuant une voltampérométrie cyclique ou CV dans des fenêtres de potentiel allant de 0,2 à 0,9 volts, de 0,2 à 1,2 volts et de 0,2 à 1,35 volts à une vitesse de 100 millivolts par seconde dans une solution d'acide sulfurique 0,1 molaire et de chlorure de potassium 0,01 molaire. Mesurer le courant de charge de la double couche du substrat en or nu nettoyé en réalisant une CV dans des conditions standard, incluant une fenêtre de potentiel de 0,1 à 0,4 volts par rapport à l'argent/chlorure d'argent, balayée à 100 millivolts par seconde dans un tampon phosphate de potassium ou KPB.

Jetez le tampon et rincez deux fois abondamment avec de l'eau ultra-purifiée et de l'éthanol. Exposez le substrat d'or nettoyé à environ 300 microlitres d'une solution de C6 à cinq millimolaire dans l'éthanol et laissez reposer toute la nuit pour former un SAM ordonné de C6. Jetez la solution de C6 provenant de la cellule et rincez-la deux fois abondamment avec de l'éthanol et de l'eau ultra-purifiée.

Mesurez le courant de charge du SAM dans des conditions standard. Éliminez le KPB et rincez abondamment deux fois avec de l'eau ultra-pure et de l'éthanol. Le courant de charge devrait être nettement réduit.

Par rapport à celle des mesures sur or nu, exposer le substrat d'or modifié par une monocouche auto-assemblée (SAM) à environ 300 microlitres d'une solution de NDT à cinq millimoles dans l'éthanol et laisser reposer pendant une heure afin de disperser uniformément les molécules d'ancrage NDT au sein de la SAM en C6. Éliminer la solution de NDT et rincer deux fois abondamment et soigneusement avec de l'éthanol et de l'eau ultra-pure, puis une fois avec du dichlorométhane. Exposer le substrat d'or à une solution d'MPC dans du dichlorométhane sous agitation, en faisant barboter lentement du gaz azote pendant une heure.

Ceci est la couche MPC d'ancrage de l'assemblage du film. Jetez la solution MPC et rincez à nouveau successivement avec du dichlorométhane, de l'eau ultra-purifiée et du KPB. Mesurez le courant de charge de la couche MPC dans des conditions standard.

Jetez le KPB et rincez abondamment avec de l'eau ultra-purifiée et du méthane DIAM. Exposez le substrat d'or à environ 300 microlitres d'une solution de NDT à cinq millimolaire dans du méthane DIAM sous agitation, en faisant buller lentement du gaz azote pendant 20 minutes. Jetez le NDT et rincez soigneusement avec du méthane DIAM pour déposer la deuxième couche de MPC.

Réimmerger l'assemblage de film dans la solution MPC de méthane DIAM et laisser tremper avec agitation en faisant buller lentement du gaz azote pendant une heure avant les rinçages. Ensuite, mesurer à nouveau le courant de charge de la couche MPC dans des conditions standard et rincer de nouveau en utilisant la même procédure. Déposer des couches MPC supplémentaires si souhaité.

Une fois le film MPC réticulé terminé, rincer le substrat modifié par le film avec du KPB afin d'adsorber la protéine AZ sur l'assemblage du film MPC. Injecter environ 150 microlitres d'une solution d'AZ à cinq à 10 micromolaire dans du KPB dans la cellule électrochimique en configuration « sandwich », puis laisser reposer, bouchonnée et réfrigérée, pendant au moins une heure. Une fois la cellule ECM revenue à température ambiante, la rincer soigneusement avec du KPB, la remplir à nouveau avec du KPB et saturer le KPB en gaz azote pendant 10 minutes.

Réalisez des études électrochimiques en couche unique, telles que la CV, dans une fenêtre de potentiel allant de moins 0,25 volt à 0,25 volt. Balayez à 100 millivolts par seconde dans du KPB. Rincez la lame de verre modifiée par du 3M PT MS avec du méthane DIAM, puis placez-la dans une solution MPC de méthane DIAM pendant une heure, sous agitation douce sur un agitateur. Cette étape achève la première couche MPC de l'assemblage du film en ancrant les MPC aux groupes terminaux ME captan du sane.

Rincez soigneusement la lame avec du méthane Dior, séchez-la avec du gaz azote et enregistrez un spectre UV-visible de la lame après l'avoir trempée dans une solution NDT en méthane diam. Placez la lame dans une solution MPC pendant une heure en agitant sur un agitateur à vitesse lente. Cette étape achève la deuxième couche MPC de l'assemblage du film.

Rincez soigneusement la lame avec du méthane DIAM, séchez-la avec du gaz azote et enregistrez un spectre UV-visible de la lame. L'absorbance à travers le spectre devrait augmenter à mesure que des couches supplémentaires de MPC sont absorbées par l'assemblage du film. Pour fixer un film MPC assemblé sur une lame de verre modifiée par 3M PT MS sur une lame de microscope standard.

Préparez la résine époxy 12 en huit et laissez-la épaissir pendant au moins 12 heures. Remplissez une capsule de faisceau avec de la résine époxy et retournez-la au-dessus de l'échantillon de film MPC. Appliquez une pression sur la capsule afin qu'une bulle remonte vers le haut de la capsule, créant ainsi un joint étanche entre la résine époxy et l'échantillon de film MPC.

Laisser polymériser pendant au moins 18 heures à 60 degrés Celsius, puis refroidir les lames montées à température ambiante. Chauffer les lames montées pendant 20 secondes sur une plaque chauffante en aluminium moulé à 200 degrés Celsius afin de faciliter le retrait du bloc avec le MPC fixé sur le film rapide. Découper l'échantillon contenant le film du bloc de capsule de faisceau à l’aide d’une lame de scie à bijoutier, puis placer la partie retirée dans un moule plat en silicone, le côté du film MPC vers le haut, face à l’intérieur du silicone.

Remplir le puits en silicone avec de la résine époxy à température ambiante et laisser polymériser pendant au moins 18 heures à 60 degrés Celsius. Ensuite, ramener l'échantillon à température ambiante. Couper des sections minces de 60 à 80 nanomètres à l’aide d’un microtome ultram mince Leica UCT en utilisant un couteau en diamant pour réaliser des coupes perpendiculaires au tranchant du couteau, placer les sections découpées sur un film de support en carbone VAR sur des grilles en cuivre de 400 mesh, puis acquérir des images en microscopie électronique en transmission (MET) des sections transversales des assemblages de films MPC.

Voici les résultats de la surveillance du courant de charge de la double couche lors de la croissance du film MPC, effectuée sur un total de cinq cycles d'immersion alternant entre des solutions de MPC et de NDT. Les courants de charge augmentent systématiquement à chaque cycle d'immersion. Ajout de couches de MPC au film.

Voici un cycle typique de Volta Graham pour l'ajout de AZ par absorption dans un assemblage de film MPC, enregistré à l'aide d'une fenêtre de potentiel allant de -0,25 à +0,25 volt, balayée à 100 millivolts par seconde dans un tampon phosphate de potassium à 4,4 millimolaire. Un suivi spectral représentatif dans l'UV-visible de la croissance d'un film MPC lié par un diol sur une lame de verre modifiée avec du 3M PT MS est présenté ici. Un cycle d'immersion comprend l'exposition de la lame de verre à une solution de lien NDT, suivie d'une exposition à une solution MPC.

Chaque trempe ultérieure entraîne une augmentation de l'épaisseur du film et une augmentation concomitante de l'absorbance. Cette figure présente une analyse en microscopie électronique en transmission d'une coupe transversale d'un assemblage de film MPC lié par DIA. L'encart montre une image typique de microscopie électronique en transmission de MPC fonctionnalisés par l'hexa méthol, utilisés dans l'analyse en MET de l'assemblage du film.

À l'aide d'ImageJ, le diamètre moyen du noyau d'or des MPC a été déterminé à environ deux nanomètres. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la synthèse, de la caractérisation et de l'assemblage de films de MPC en paires dorées étroites agissant comme interface pour l'absorption et l'analyse électrochimique ultérieure des protéines redox. Le processus d'assemblage des films peut facilement être adapté en modifiant la procédure de synthèse des MPC ainsi que le mécanisme de liaison interparticulaire afin de permettre l'absorption d'une grande variété de protéines.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'électrochimie de l'absorption des protéines par des plateformes synthétiques modifiées, elle peut également être appliquée au développement de systèmes de modélisation du transfert d'électrons, de dispositifs de biosensation et de matériaux synthétiques biocompatibles.