Murine chirurgie superficielle des ganglions lymphatiques
21 mai 2012
Pour suivre la progression d'une réponse immunitaire au fil du temps au sein de la même souris, des ganglions lymphatiques peut être enlevé par chirurgie séquentielle. Ici, nous décrivons comment cette technique peut être réalisée.
L'objectif général de cette procédure est d'extraire chirurgicalement des ganglions lymphatiques d'une souris anesthésiée. Cette opération consiste tout d'abord à localiser les ganglions lymphatiques. Ceux-ci sont ensuite prélevés, puis l'incision est refermée.
Enfin, une suspension monocellulaire peut être obtenue pour l'analyse expérimentale. En définitive, les populations de lymphocytes viables peuvent être évaluées par cytométrie en flux. La démonstration visuelle de cette technique est essentielle, car la localisation et l'ablation des ganglions lymphatiques doivent être observées pour être maîtrisées.
Après avoir anesthésié la souris, appliquez une pommade ophtalmique, injectez de la buprénorphine et confirmez la sédation par une pincée du orteil, puis placez la souris sur le côté. Localisez d'abord le ganglion lymphatique brachial, puis rasez la région à disséquer. Après avoir brossé les poils détachés, appliquez un désinfectant sur la zone, puis pratiquez une petite incision d'environ cinq millimètres à l'arrière de la patte arrière.
Utilisez deux paires de forceps pour étirer l'incision jusqu'à ce que le ganglion lymphatique brachial, qui peut apparaître grisâtre ou plus foncé que la graisse environnante, soit visible. Pincez ensuite la fascia recouvrant le ganglion lymphatique avec une paire de forceps. Placez la seconde paire de forceps aussi profondément que possible sous le ganglion lymphatique et tirez légèrement sur la membrane sans rompre les tissus environnants.
Ensuite, utilisez la première paire de forceps pour rompre le fascia et retirer le ganglion lymphatique. Si le ganglion lymphatique a été correctement prélevé, une tache de sang apparaîtra à l'endroit où il se trouvait précédemment. Placez le ganglion lymphatique excisé dans une solution isotonique ; s’il coule, cela confirmera que le tissu prélevé est un ganglion lymphatique et non de la graisse.
Ensuite, vérifiez qu'aucun poil ne se trouve dans la plaie et fermez l'incision en rapprochant les deux bords internes de la peau et en les fixant avec un ou deux agrafes, selon la taille de l'incision. Localisez maintenant un ganglion lymphatique inguinal et rasez la région à disséquer. Après avoir brossé soigneusement les poils détachés, appliquez un désinfectant sur la zone, puis pratiquez une petite incision d'environ cinq millimètres au-dessus de la patte postérieure, près de l'abdomen.
Après avoir ouvert l'incision à l’aide de deux paires de forceps comme indiqué précédemment pour le ganglion lymphatique brachial, identifier le ganglion lymphatique inguinal niché dans le tissu adipeux environnant. Ensuite, retirer le ganglion lymphatique à l’aide des deux paires de forceps, comme démontré précédemment. Confirmer à nouveau le prélèvement réussi du ganglion lymphatique en observant la tache de sang qui apparaît à l’emplacement où se trouvait précédemment le ganglion lymphatique, puis déposer le ganglion lymphatique inguinal dans un récipient séparé contenant une solution isotonique.
Une fois tous les ganglions lymphatiques prélevés, placer la souris dans une cage et ajouter de la nourriture humide afin qu'elle puisse s'alimenter facilement. Environ six à huit heures après l'intervention chirurgicale, vérifier que la souris ne ressent pas de douleur. Observer attentivement que la posture, la démarche, l'interaction avec les congénères et l'apparence du pelage sont similaires à ceux d'une souris normale et en bonne santé.
Enfin, dissocier le ganglion lymphatique en l'appuyant contre des lames dépolies dans une boîte de Pétri, puis le transférer dans un tube afin d'obtenir une suspension monocellulaire. Après coloration des cellules pour les antigènes membranaires d'intérêt, analyser les cellules par cytométrie en flux. Ici, des graphiques de dispersion de la diffusion avant et latérale sont présentés pour des ganglions lymphatiques prélevés sur des animaux soit anesthésiés, soit sacrifiés.
Les profils et pourcentages de cellules dans les fenêtres de lymphocytes viables des deux nuages de points sont identiques. Cela démontre que la chirurgie des ganglions lymphatiques est une technique appropriée pour la collecte de cellules. Une fois maîtrisée, la chirurgie des ganglions lymphatiques peut être réalisée en cinq à dix minutes par souris, à condition d'être effectuée correctement.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cet article décrit une technique chirurgicale permettant de prélever séquentiellement des ganglions lymphatiques chez une souris anesthésiée afin de suivre la réponse immunitaire au fil du temps. Le protocole comprend la localisation des ganglions lymphatiques, leur prélèvement, la fermeture de l'incision, puis l'obtention d'une suspension monocellulaire pour analyse.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Immunologie
- Techniques chirurgicales
- Analyse expérimentale
Contexte
- La compréhension des réponses immunitaires est essentielle dans la recherche.
- Les ganglions lymphatiques jouent un rôle clé dans le système immunitaire.
- La suppression séquentielle permet une analyse temporelle des réponses immunitaires.
- Les techniques visuelles améliorent l'apprentissage et la maîtrise de la procédure.
Objectif de l'étude
- Démontrer l'ablation chirurgicale des ganglions lymphatiques chez la souris.
- Faciliter l'étude de la progression de la réponse immunitaire.
- Fournir un guide visuel aux chercheurs.
Méthodes utilisées
- Localisation des ganglions lymphatiques chez une souris anesthésiée.
- Ablation chirurgicale des ganglions lymphatiques.
- Fermeture de l'incision après la chirurgie.
- Préparation d'une suspension de cellules uniques pour analyse.
Résultats principaux
- La suppression réussie des ganglions lymphatiques a été réalisée.
- Des populations viables de lymphocytes ont été obtenues.
- La cytométrie en flux a été utilisée pour l'évaluation des lymphocytes.
- Des démonstrations visuelles ont amélioré la compréhension de la technique.
Conclusions
- La technique permet un suivi efficace des réponses immunitaires.
- Les aides visuelles sont essentielles pour maîtriser les procédures chirurgicales.
- De futures études pourront s'appuyer sur cette méthode afin d'obtenir des connaissances plus approfondies.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La chirurgie séquentielle des ganglions lymphatiques permet un suivi longitudinal des réponses immunitaires au sein du même animal, réduisant ainsi la variabilité expérimentale et soutenant la détection mécanistique des risques lors de la validation ciblée. Cette approche fournit un nombre suffisant de lymphocytes viables pour des essais phénotypiques et fonctionnels, renforçant la fiabilité prédictive des études précliniques en immunologie. En facilitant des expériences en cours de temps, la technique soutient une continuité translationnelle allant de la découverte à la validation préclinique.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques grâce à l'analyse temporelle de l'expansion des lymphocytes dans les ganglions lymphatiques.
- Valeur opérationnelle : Réduit l'utilisation d'animaux et la variabilité expérimentale en permettant des prélèvements répétés chez la même souris.
- Valeur scientifique : Contribue à l'évaluation du risque biologique en caractérisant au fil du temps les phénotypes des lymphocytes présents dans les ganglions lymphatiques.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Permet d'obtenir 1-2x10⁶ cellules par ganglion lymphatique, suffisant pour la caractérisation phénotypique et les tests fonctionnels.
- Valeur opérationnelle : Fournit des suspensions cellulaires standardisées et reproductibles destinées à l'analyse en cytométrie de flux en aval.
- Valeur scientifique : Permet la préparation de systèmes biologiques validés pour une évaluation fiable des composés dans le cadre de criblages en immunologie.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Permet la modélisation de systèmes pertinents pour les maladies en suivant la dynamique des cellules immunitaires dans les ganglions lymphatiques au fil du temps.
- Valeur opérationnelle : Facilite l'alignement des biomarqueurs translationnels grâce à une surveillance immunitaire longitudinale.
- Valeur scientifique : Renforce la confiance prédictive dans les modèles précliniques en permettant une détection mécanistique des voies immunitaires à risque.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre dans le continuum de la découverte, de la vérification des hypothèses à la validation préclinique, en soutenant le suivi de la réponse immunitaire et l'analyse fonctionnelle des lymphocytes.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques par l'analyse temporelle des réponses immunitaires.
- Criblage : Permet la mise en place d'essais grâce à des suspensions monocellulaires reproductibles obtenues à partir de ganglions lymphatiques prélevés.
- Analytique : Génère des populations quantitatives de lymphocytes pour des comparaisons fondées sur la cytométrie en flux entre différents points temporels.
- Recherche translationnelle : Relie la découverte à la validation préclinique par une surveillance immunitaire continue dans des systèmes pertinents pour la maladie.
- Réutilisation institutionnelle : Représente une capacité chirurgicale réutilisable pour des études longitudinales en immunologie menées dans le cadre de plusieurs projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans la validation des cibles grâce au suivi longitudinal de la réponse immunitaire.
- Valeur opérationnelle : Normalisation et reproductibilité du prélèvement et du traitement des lymphocytes.
- Valeur stratégique : Décisions améliorées d'aller/ne pas aller grâce à une réduction de l'ambiguïté mécanistique dans les programmes d'immunologie.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation ajustée au risque basée sur les données temporelles de réponse immunitaire issues d'échantillonnages séquentiels.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en techniques chirurgicales murines et en protocoles d'anesthésie.
- Exige un matériel stérile et des solutions isotoniques pour la préservation des tissus.
- Implique une standardisation entre équipes pour une localisation et une collecte cohérentes des ganglions lymphatiques.
- Suppose des adaptations selon les sites de ganglions lymphatiques (brachial, inguinal) et les souches de souris.
- Limité par les intervalles de récupération postopératoire, permettant un échantillonnage tous les deux jours par ganglion.
