La détection de l'hypoxie dans le cortex de souris microrégionale cérébrale par imagerie à deux photons de fluorescence endogène NADH

L'objectif général de cette procédure est de visualiser directement l'hypoxie tissulaire micro-régionale dans le cortex de la souris in vivo. Cela est réalisé en préparant d'abord une fenêtre crânienne ouverte chez une souris anesthésiée. Ensuite, un colorant fluorescent est injecté par voie intraveineuse afin de marquer les vaisseaux sanguins cérébraux.

Enfin, une imagerie concomitante des photons provenant de la fluorescence intrinsèque du NADH et de la microvasculature corticale marquée par fluorescence est réalisée. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant une hypoxie fonctionnelle dans de petites régions du parenchyme cérébral grâce à la visualisation de la forme réduite de la nicotinamide adénine dinucléotide. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les électrodes de type Clark, est qu'elle offre une résolution spatiale élevée sur un large champ de vision et qu'elle est également moins invasive.

Cette méthode peut être réalisée sur un système photo à deux canaux fluorescents standard. Bonjour, je suis Steve Hurst, professeur et chef du département de microbiologie et d'immunologie à l'Université de Rochester. La procédure sera démontrée aujourd'hui par le fils d'Anita du laboratoire Kishka, ainsi que par Oxana Paulka, professeure assistante de recherche de mon laboratoire. Le Dr Kishka, qui a mis au point la technique d'imagerie du NADH, ne peut pas être présent aujourd'hui car il vient de s'installer en Allemagne. Après avoir préparé le site chirurgical avec les instruments nécessaires, stérilisés au moyen d'un autoclave ou désinfectés à l'éthanol à 70 %, et anesthésié la souris avec 5 % d'isoflurane, placez-la sur un tapis chauffant et appliquez un masque facial pour délivrer 1,3 à 1,5 % d'isoflurane dans l'air.

Vérifiez le niveau d'anesthésie en pinçant la queue. Ensuite, insérez une sonde rectale et mesurez en continu la température corporelle de l'animal tout au long de la procédure. Appliquez un gel lacrymal artificiel sur les yeux de la souris pour éviter qu'ils ne s'assèchent.

Ensuite, rasez les poils de la tête et appliquez un produit dépilatoire sur chaque cuisse pendant deux minutes afin d'éliminer les poils résiduels ; la cuisse sera utilisée pour l'oxymétrie. Enfin, désinfectez le cuir chevelu à l'aide d'une solution de povidone iodée à 10 % et d'éthanol à 70 %. Pour réaliser une fenêtre crânienne, commencez par inciser le crâne sur cinq millimètres à l'aide de ciseaux.

Effectuez une incision dans le cuir chevelu et avancez d'un centimètre. Écartez la peau sur les côtés pour exposer le crâne. Retirez les membranes situées au-dessus du crâne. Appliquez une solution de chlorure ferrique à 10 %.

Essuyez la solution en excès et grattez délicatement les membranes avec un angle de 45 degrés. Numéro cinq, pince. À l’aide d’un microscope de dissection, identifiez la zone d’intérêt. Appliquez une fine couche de colle rapide autour des bords de la fenêtre de la plaque crânienne.

Positionner la plaque crânienne de manière à ce que la zone d’intérêt soit exposée dans la fenêtre, puis exercer une légère pression sur la plaque crânienne. Appliquer une petite quantité de ciment dentaire pour polymériser rapidement la colle. Maintenir pendant 10 secondes pendant que la colle polymérise.

Appliquer une petite quantité de colle rapide sur les bords de la fenêtre pour sceller la plaque crânienne et le crâne. Ensuite, visser la plaque crânienne sur le support de l'animal sous la loupe stéréo. Utiliser le micro-torque deux perceuse réglée à 6 000 tr/min et le foret IRF 0 0 5.

Retirez tout excès de colle du crâne et de la plaque crânienne. Réglez ensuite le foret à mille tr/min et commencez à percer le crâne en traçant un cercle à l’intérieur de la fenêtre de la plaque crânienne, d’un diamètre d’environ cinq millimètres. Utilisez des mouvements légers et balayants, comme si vous dessiniez avec un crayon très tendre.

Arrêtez le perçage toutes les 20 à 30 secondes et utilisez de l'air comprimé pour éliminer la poussière osseuse. Au fur et à mesure de l'avancement du perçage, une rainure se forme autour du crâne intact situé au centre. Veillez à ne pas percer le crâne mince, mais à garantir que cette rainure présente une épaisseur uniforme.

En outre, soyez particulièrement prudent près des gros vaisseaux sanguins. Ils ne doivent pas être endommagés et, si possible, ne doivent même pas être touchés. À l’aide d’une des pointes d’une pince, soulevez l’os situé au centre de la fenêtre et appliquez une goutte de liquide céphalorachidien artificiel sur la fenêtre. À l’aide d’un coin d’un essuie-tout Kim, essuyez délicatement le liquide céphalorachidien artificiel selon un angle de 45 degrés.

Numéro cinq, la pince. Repérez une région de dure-mère endommagée le long du bord de la fenêtre et soulevez-la pour l'extraire. En cas de saignement, appliquez une goutte de LCS artificiel et attendez deux à trois minutes afin qu'un saignement mineur cesse.

Ensuite, préparez 10 millilitres de 0,07 % d'aéro à bas point de fusion dissous dans du liquide céphalorachidien artificiel. Portez l'aéro fondu à la température corporelle. Essuyez l'excès de liquide céphalorachidien artificiel à la surface du cerveau.

Verser l'aéro dans la fenêtre et la recouvrir d'une lame de verre. Ensuite, appuyer doucement sur la lame pour assurer le contact entre celle-ci et la plaque de tête, puis attendre de 10 à 20 secondes jusqu'à ce que l'aéro soit solidifié. À l'aide de pinces et de papier essuie-tout doux, retirer l'excès d'aéro sur la lame de verre.

Mettez une petite quantité de colle rapide autour du verre pour le fixer à la plaque crânienne. Appliquez ensuite une petite quantité de ciment dentaire pour solidifier la colle avant l'injection dans la veine fémorale. Tournez partiellement l'animal afin d'exposer l'intérieur de la cuisse gauche.

Utilisez du ruban adhésif pour immobiliser l'animal. Dans cette position, appliquez un antiseptique cutané, puis de l'éthanol à cent pour cent sur la peau. Ensuite, pratiquez une incision le long de la face médiale de la cuisse, depuis le genou jusqu'à la symphyse pubienne.

Si nécessaire, séparez les tissus mous par une dissection émoussée. Remplissez une seringue d'un millilitre avec 130 microlitres de Texas red. Fixez une nouvelle aiguille de calibre 30 et pliez-la soigneusement à un angle de 30 degrés, en gardant le biseau vers le haut.

Remplir l'aiguille avec la solution de Texas Red sous un microscope stéréo, insérer l'aiguille dans la veine fémorale et injecter cent microlitres de Texas Red. Retirer l'aiguille et appuyer légèrement sur la veine avec de la gaze pour arrêter le saignement. Fermer la peau à l’aide d’un point de suture en surjet pour un suivi continu de la saturation en oxygène du sang.

Placer la sonde de l'oxymètre sur la cuisse droite dont les poils ont été préalablement retirés. Pour commencer l'imagerie, transférer la souris préparée chirurgicalement sur la platine du microscope. Prendre une image initiale du site de la fenêtre crânienne en utilisant une illumination en champ clair à un grossissement de quatre fois, afin de servir de carte de référence pour le recalage avec un grossissement plus élevé destiné à l'acquisition de photons.

Zoomer sur la zone d’intérêt en utilisant un grossissement de 10 x. Sélectionner une zone d’intérêt dans les couches corticales. Une ou deux pour commencer l’enregistrement de la série temporelle.

Nous recommandons d'utiliser en moyenne de trois à cinq images pour améliorer la qualité de l'image. Ensuite, induire une hypoxémie en ajoutant 50 % d'azote à l'air que respire l'animal. Cela ramènera le taux d'oxygène à 10 %. Vérifier l'hypoxémie en surveillant les données du oxymètre.

Continuer à enregistrer la série temporelle pendant l’hypoxémie pendant environ 30 secondes, puis après la restauration du niveau normal d’oxygène. Recueillir des données pour le calcul de la distribution de l’oxygène en détectant, mesurant et quantifiant la surface des zones d’hypoxie et des cylindres de tissu oxygéné autour des vaisseaux sanguins. Pour déterminer le rayon R du cylindre de tissu croak, mesurer la distance entre le centre du vaisseau sanguin et la limite à laquelle une fluorescence élevée de NADH est détectée.

Se référer au protocole écrit pour les méthodes de traitement des données. Cette figure montre des images simultanées de NADH et de géographie provenant d'une vidéo enregistrée pendant une hypoxémie transitoire, au cours de laquelle la concentration d'oxygène inspiré a été réduite de 21 % à 10 % pendant une période de trois minutes. Ce niveau d'hypoxémie induite expérimentalement est suffisant pour provoquer une hypoxie sévère dans le cortex cérébral.

L'hypoxie a entraîné une augmentation de la fluorescence du NADH, initialement visible en vert dans les zones les plus éloignées de l'apport sanguin artériel. Remarquez les limites tissulaires nettes du NADH, qui représentent les frontières observables de la diffusion de l'oxygène à partir de la microcirculation corticale, montrée en rouge. Voici une image simultanée des microvaisseaux marqués par fluorescence en rouge et de la fluorescence intrinsèque du NADH provenant de la substance grise du cortex en vert ; la distribution de l'intensité de la fluorescence du NADH est binaire.

Il existe des zones présentant une faible fluorescence de NADH de manière uniforme et des zones présentant une forte fluorescence de NADH de manière uniforme. Les lignes jaunes représentent les limites tissulaires entre les zones à faible et à forte fluorescence de NADH. Ces limites tissulaires présentent une relation spatiale avec les microvaisseaux voisins.

Cette relation est déterminée par la diffusion de l'oxygène à partir des microvaisseaux vers les tissus. Dans certains cas, la nature cylindrique ou le cylindre tissulaire CRO de ces limites tissulaires peut être directement reconnue, comme indiqué par les lignes bleues. Ici, la limite tissulaire présente une forme circulaire avec un vaisseau sanguin central concentrique, une fois maîtrisée.

Cette technique peut être réalisée en 1,5 heure si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de coller la lame de couverture sur la plaque métallique afin d'éviter tout mouvement vertical de la surface corticale dû à l'œdème. Après cette procédure, des analyses supplémentaires peuvent être effectuées, comme des mesures de l'hyperémie fonctionnelle, dans le but de répondre à d'autres questions, telles que la relation entre l'hypoxie tissulaire et le couplage cérébrovasculaire.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment visualiser l'hypoxie tissulaire micro-régionale dans le cortex de la souris.