Détection directe de l'activité Acétate de formation de l'acétate kinase Enzyme

Cette expérience vise à mesurer directement l'activité de formation d'acétate de l'acétate kinase. Initiez la réaction en ajoutant l'enzyme à un mélange réactionnel contenant l'acétyl phosphate et les substrats DP. Ajoutez ensuite de l'hydroxylamine hydrochlorure pour convertir l'acétyl phosphate restant en acétyl hydroxylate.

Ajouter la solution de développement pour convertir l'acétyl hydroxylate en un complexe coloré de ferric hydroxylate pouvant être mesuré. La mesure spectrophotométrique, basée sur la quantité de substrat acétyl phosphate consommé lors de la réaction, permet la détermination des paramètres cinétiques de l'enzyme. L'avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans le fait qu'elle repose sur la mesure directe de la consommation d'acétyl phosphate plutôt que sur le découplage d'une production de TP liée à la réduction d'un ADP. Étant donné que ce dosage ne dépend pas de la production de TP, il peut être utilisé pour un nouveau groupe d'acétate kinases, qui produisent du phosphate de pouvoir au lieu de TP. Pour une courbe standard de six à huit points, diluer la solution mère d'acétyl phosphate dans du triss 100 millimolaire jusqu'à un volume final de 300 microlitres. Inclure également un échantillon témoin sans acétyl phosphate. Équilibrer tous les échantillons dans un bloc chauffant à 37 degrés Celsius pendant une minute.

À présent, ajoutez 50 microlitres de chlorure d'hydroxylamine à deux molar, mélangez en agitant trois fois, puis incubez dans un bloc chauffant à 60 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution de développement, mélangez en agitant trois fois et laissez la couleur se développer pendant au moins une minute à température ambiante. Centrifugez les échantillons en utilisant des cuvettes en plastique destinées au spectrophotomètre.

Mesurez les échantillons à 540 nanomètres. Procédez à la génération d'une courbe standard d'absorbance à 540 nanomètres en fonction des micromoles d'acétyl phosphate à l'aide d'un logiciel approprié d'analyse de données et de tracé de graphiques. Calculez la valeur de r carré.

Répartir des aliquotes de 300 microlitres du mélange réactionnel dans des tubes de microcentrifugeuse. Pensez à inclure une réaction témoin sans enzyme ; équilibrer les tubes pendant une minute à 37 degrés Celsius. Si plusieurs réactions sont effectuées, ajouter l'enzyme dans les tubes à des intervalles de temps précis et replacer immédiatement chaque tube dans le bloc chauffant à 37 degrés Celsius.

Après cinq minutes, ajouter 50 microlitres de chlorhydrate d'hydroxylamine deux molaire, mélanger et incuber cinq minutes à 60 degrés Celsius. Ensuite, ajouter 100 microlitres de la solution de développement, mélanger et laisser à température ambiante pour le développement de la couleur. Puis centrifuger les échantillons à 18 000 ×g pendant une minute.

Procédez au mesurage de l'absorbance à 540 nanomètres. Déterminez la quantité d'acétyl phosphate présente par comparaison avec la courbe standard d'acétyl phosphate. Les données peuvent être représentées graphiquement et ajustées à l'équation de McKayla Cementin pour la détermination des paramètres cinétiques.

Cet essai permet de déterminer la consommation du substrat acétyl phosphate afin de mesurer l'activité de l'acétate kinase dans le sens de la formation de l'acétate. L'acétyl phosphate restant après une durée donnée de la réaction enzymatique est converti en acétyl oxybate, puis en complexe hydroxyde ferrique, qui présente une couleur rougeâtre mesurable à 540 nanomètres. Cette courbe standard typique, portant sur l'absorbance à 540 nanomètres en fonction des micromoles d'acétyl phosphate, présente une pente de 1,2332 unité d'absorbance par micromole d'acétyl phosphate.

La valeur de r carré obtenue de 0,99 indique que les données s'ajustent bien à l'équation linéaire telle qu'elle est représentée ici. Ce dosage peut être utilisé pour déterminer le KM de l'acétyl phosphate pour diverses préparations enzymatiques. À cinq millimolaire de DP, avec des concentrations variables d'acétyl phosphate, la kinase de l'acétate recombinante purifiée provenant de *Methanolobus thermophilus* suit des cinétiques classiques de type Michaelis-Menten pour chaque substrat, conduisant à un KM apparent de 0,27 ± 0,01 millimolaire d'acétyl phosphate.

Contrairement au dosage couplé classique, ce dosage direct peut mesurer l'activité d'acétate kinases utilisant des substrats autres que l'ATP. Par exemple, lors de l'utilisation de l'acétyl-phosphate par l'acétate kinase d'Entamoeba histolytica produisant du pyrophosphate, le phosphate de sodium a été substitué au ADP dans le mélange réactionnel. La courbe obtenue indique une valeur apparente de KM de 0,50 ± 0,006 millimolaire pour l'acétyl-phosphate. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mesurer directement l'activité de l'acétate kinase en déterminant la quantité d'acétyl-phosphate consommée.

Un facteur clé pour obtenir des résultats reproductibles est d'être constant à chaque étape, en particulier lors de l'ajout de l'enzyme et de l'étape de mélange.