Multiplexée unique molécule mesures Protéolyse forcer l'utilisation de pinces magnétiques

L'objectif général de cette procédure est d'étudier l'effet de la charge mécanique sur le clivage protéolytique de protéines individuelles de manière hautement parallèle et rentable. Dans cette démonstration, le clivage du collagène par la métalloprotéinase matricielle un est examiné dans un premier temps : des trimères de collagène sont fixés sur la lame de verre d'une cellule d'écoulement, puis des billes magnétiques de taille micrométrique sont attachées aux molécules individuelles de collagène. La deuxième étape consiste à monter la cellule d'écoulement dans l'appareil de pinces magnétiques et à vérifier que les billes fixées de manière non spécifique ont été éliminées de la surface de la lame.

Ensuite, la protéase est ajoutée aux cellules d'écoulement. La dernière étape consiste à déterminer la vitesse de protéolyse en surveillant en temps réel le détachement des billes. En mesurant les taux de détachement des billes à différentes concentrations de protéase et à différentes forces, il est possible d'obtenir des paramètres cinétiques zoologiques standards en utilisant des quantités minimes de substrat et de protéase.

En outre, cette technique fournit des informations uniques sur l'effet de la force mécanique sur la vitesse de protéolyse et sur les changements structuraux du protéine substrat qui accompagnent le clivage. Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes telles que les traces optiques T et la microscopie à force atomique réside dans sa capacité de traitement élevé et son faible coût. Bien que cette méthode permette d'obtenir des indications sur la force effective exercée lors du clivage protéolytique de protéines uniques, les instruments et techniques peuvent être appliqués à un large éventail de problèmes biophysiques, notamment l'effet de la force sur le repliement des protéines et la conformation.

Commencez la préparation de la cellule d'écoulement en nettoyant les lamelles par sonication. Ajoutez les lamelles dans un petit récipient en verre pouvant les contenir et s'adaptant dans le bain de l'ator. Remplissez le récipient avec de l'isopropanol et soniquez pendant 20 minutes dans un bain ator, puis rincez les lamelles avec de grandes quantités d'eau déionisée.

Remplir le récipient d'eau et soniquer pendant 20 minutes. Après la sonication, sécher les lamelles dans un courant d'air filtré exempt de poussière. Examiner les lamelles et n'utiliser que celles qui sont exemptes de traces.

Flambez doucement les lamelles pendant quelques secondes afin de les nettoyer de toute poussière ou humidité résiduelle en faisant passer les lamelles à travers une flamme de gaz produite par un bec Bunsen, en prenant soin de ne pas déformer la lamelle à cause d'une chaleur excessive. Cette étape élimine les contaminants résiduels présents à la surface.

Ensuite, utilisez du ruban adhésif double face pour fixer les deux lamelles ensemble. Commencez par découper le ruban sur une longueur d'environ trois centimètres et une largeur de 0,3 centimètre, puis appliquez-le sur une lamelle de 22 par 40 millimètres, en laissant un canal de 1,6 centimètre au milieu. Utilisez la pointe d'une pipette pour appuyer doucement sur la lamelle afin de vous assurer que le ruban adhère correctement.

L'appareil de pinces magnétiques a été construit par ce laboratoire à l'aide d'un support en aluminium en forme de L comportant un orifice circulaire d'un millimètre de diamètre, monté sur un translateur vertical Z afin de moduler la hauteur des pinces. Deux aimants permanents en terre rare ont été fixés de part et d'autre de l'orifice sur le support afin de créer un gradient de champ magnétique. Un étalonnage correct du piège magnétique est essentiel à cette procédure.

Pour garantir le succès, nous utilisons deux méthodes différentes décrites dans cette section. Pour étalonner le piège magnétique, utilisez l'ADN préparé précédemment à partir du phage Lambda, marqué à ses extrémités 5' et 3' par la biotine et la doxygénine, comme indiqué dans le protocole écrit. Pour fixer l'ADN sur la cellule d'écoulement, commencez par remplir la cellule d'écoulement avec une solution d'anticorps anti-doxygénine et laissez l'anticorps adhérer à la surface en verre pendant 15 minutes.

Ensuite, bloquer la surface de la cellule à écoulement pour éviter l'adhérence non spécifique de l'ADN en ajoutant une solution de BSA dans la cellule à écoulement. Remarque : pour cette étape de blocage et pour toutes les étapes ultérieures, le volume du réactif ajouté dans la cellule à écoulement doit être au moins deux fois supérieur au volume de la cellule. Le volume de la cellule à écoulement, qui est dans cette démonstration de 75 microlitres, incuber la cellule à écoulement à température ambiante pendant 45 minutes.

Après avoir répété cette étape, ajoutez 50 pico molaire d'ADN lambda fonctionnalisé et laissez-le s'attacher à la lame pendant 15 minutes, puis rincez l'excès d'ADN avec un XPBS. Enfin, ajoutez des billes superparamagnétiques revêtues de streptavidine et laissez-les s'attacher à l'ADN immobilisé pendant 15 minutes. Dans cette démonstration, des billes de 2,8 micromètre sont utilisées.

Éliminer les billes en excès avec un XPBS. Ensuite, effectuer l'étalonnage des pinces magnétiques en déplaçant les aimants permanents vers une position éloignée de la surface de l'échantillon. Puis placer la cellule d'écoulement préparée dans le microscope.

Placer les aimants permanents en position au-dessus de la cellule d'écoulement. Choisir le plan focal des billes fonctionnalisées par l'ADN Lambda en mettant au point sur les billes situées loin des deux surfaces de verre. Le plan focal correct est celui dans lequel les billes souhaitées présentent un centre brillant.

Enregistrez une vidéo du mouvement des billes à une fréquence supérieure à 80 hertz pendant 500 images. Rapprochez l'aimant de la surface de l'échantillon et enregistrez une vidéo du mouvement des billes à chaque position. Pour des distances supérieures à cinq millimètres, avancez par incréments d'un millimètre entre les distances de un et cinq millimètres.

Déplacez-vous par incréments de 0,5 millimètre pour des distances inférieures à un millimètre, déplacez-vous par incréments de 0,25 millimètre. Pour chaque jeu de données, suivez le centre des billes à l'aide d'un ajustement gaussien 2D. Calculez la force à partir des fluctuations browniennes comme décrit dans le protocole écrit. Vérifiez l'exactitude des forces en contrôlant le calcul de la force par un ajustement du spectre de puissance (ajustement de Lian).

Afin de déterminer la fréquence de décrochage, la relation entre la force appliquée et la fréquence de décrochage peut être établie dans le texte précédent l'attachement du peptide de collagène aux cellules d'écoulement, exprimer et purifier les protéines peptide de collagène et MMP-1. Commencez par ajouter la solution d'anticorps anti-MIC à la cellule d'écoulement et incubez à température ambiante pendant 20 minutes pour permettre à l'anticorps anti-MIC de s'attacher à la surface de la cellule d'écoulement. Bloquez la cellule d'écoulement pour éviter l'attachement non spécifique des protéines à l'aide de BSA à 5 milligrammes par millilitre. Ajoutez 150 picomolaires de peptide de collagène et laissez-le s'attacher à l'anticorps via la marque M ttag pendant 45 minutes.

Éliminer l'excès de collagène à l'aide de tampon PBS avant d'ajouter les billes de 2,8 micromètres dans la cellule d'écoulement. Elles doivent être séparées de la solution de billes revêtues de streptavidine à l'aide d'aimants puissants, puis resuspendues dans du PBS. Ce processus doit être répété trois fois.

Cette étape est essentielle pour permettre aux billes de 2,8 micromètres de se lier au peptide de collagène immobilisé à la surface. Ensuite, ajoutez les billes superparamagnétiques revêtues de streptavidine et laissez-les s'attacher aux molécules de collagène pendant 45 minutes. Une fois que la cellule d'écoulement est assemblée avec le peptide de collagène et les billes magnétiques, observez la cellule d'écoulement dans le piège magnétique.

Sous une faible force, une sous-population des billes est parfois faible, adhérant à la surface de manière non spécifique. L'application d'une force modérée garantit que ces billes sont libérées. Ajoutez l'enzyme activée à la cellule d'écoulement.

Dans ce cas, la MMP-1 a été pré-activée en ajoutant 3,5 millimolaire de PMAA et incubée à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Dès qu'une chambre d'écoulement est réintroduite dans l'appareil de pinces magnétiques, enregistrez une vidéo couvrant plusieurs champs de vision, produisant typiquement plusieurs centaines de billes attachées. Cette mesure correspond à un temps égal à zéro.

Répétez le même processus d’enregistrement de plusieurs champs de vision à intervalles de temps réguliers jusqu’à ce que toutes les billes se détachent ou qu’aucune protéolyse supplémentaire ne soit observable. Les pinces magnétiques ont été étalonnées pour des billes d’un micromètre et de 2,8 micromètres. En utilisant à la fois l’amplitude des fluctuations browniennes observées et le calcul de la fréquence de coupure à différentes positions de l’aimant lors des expériences de protéolyse forcée, le nombre normalisé de billes restantes peut être tracé en fonction du temps afin de déterminer la vitesse de protéolyse.

Et ce processus peut être répété pour différentes concentrations d'enzymes et forces. Les taux de protéolyse dépendent de la force appliquée. Les taux de protéolyse ont été déterminés à un piconewton, 6,2 piconewtons et 13 piconewtons.

La fraction de billes non dégradées, supérieure à 15 minutes, reste approximativement constante à 0,25 entre différentes expériences. Dans notre cas, le test nous a permis de mesurer l'efficacité catalytique de la MMP-1 en fonction de la force appliquée. En analysant les données, nous avons constaté que l'hélice triple du collagène doit localement se dérouler avant la protéolyse.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq à six heures si elle est effectuée correctement. Il est important de se rappeler qu'au moins 30 à 50 billes par champ d'observation sont nécessaires pour obtenir une bonne signification statistique de vos données. N'oubliez pas qu'un A PMA peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de gants, de blouses de laboratoire et de masques faciaux doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette expérience.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mesurer l'effet de la force sur le clivage protéolytique de protéines uniques à l'aide de pinces magnétiques. Les pinces magnétiques constituent un excellent outil pour l'étude d'expériences biophysiques sur des molécules uniques. Cette technique peut être étendue à d'autres combinaisons de protéases et de substrats.

En outre, des techniques similaires peuvent être utilisées pour comprendre la dynamique structurale des protéines ainsi que pour étudier d'autres protéines qui se lient ou modifient l'ARN et/ou l'ADN.