Imagerie fonctionnelle en calcium développement des réseaux corticaux

L'objectif général de cette vidéo est de montrer comment mesurer l'activité neuronale dans des tranches corticales cérébrales en développement à l'aide d'un indicateur fluorescent sensible au calcium. Des tranches cérébrales DY sont préparées à partir du cortex entéral en développement d'une souris jeune. Les neurones et les astrocytes sont tous deux chargés avec des marqueurs dépendants du calcium.

Les variations de la fluorescence des colorants dépendants du calcium reflètent les changements d'activité cellulaire. Les cellules non neuronales, notamment les astrocytes, les microglies et les cellules endothéliales, peuvent être marquées à l'aide de colorants spécifiques. L'activité du réseau cortical est enregistrée par imagerie multiphoton en laps de temps, et les cellules sont détectées au sein du réseau en réalisant un empilement d'images en 3D à travers la région d'intérêt.

Les variations de la fluorescence cellulaire au sein de plusieurs cellules peuvent ensuite être analysées afin de mesurer l'activité du réseau cortical en développement. Un schéma caractéristique de l'activité dans le système nerveux en développement est l'activité spontanée synchronisée du réseau. Cette activité synchronisée a été observée dans de nombreuses régions neuronales en développement différentes, notamment dans la moelle épinière intacte, le cortex et des préparations de cultures neuronales dissociées, durant les périodes d'activité spontanée, où les neurones, dépolarisés pour générer des potentiels d'action, émettent des potentiels uniques ou des salves d'impulsions activant de nombreux canaux ioniques, notamment des canaux calciques activés par le voltage, entraînant une entrée de calcium.

Une activité fortement synchronisée a été mesurée dans des réseaux locaux à l'aide d'électrodes de champ ou de réseaux d'électrodes multiples. Ces méthodes permettent des fréquences d'échantillonnage temporel élevées, mais offrent une résolution spatiale plus faible en raison de l'intégration des signaux d'activité cellulaire. La résolution au niveau de la cellule unique de l'activité neuronale est possible grâce à l'électrophysiologie en enregistrement par électrode à patch sur des neurones individuels pour mesurer les fréquences de décharge.

Cependant, la capacité de mesurer à partir d'un réseau est limitée au nombre de neurones enregistrés simultanément, et concerne généralement un ou deux neurones seulement. L'utilisation de colorants fluorescents indicateurs dépendants du calcium a permis de mesurer l'activité synchronisée au sein d'un réseau de cellules. Cette technique offre à la fois une excellente résolution spatiale et un échantillonnage temporel suffisant pour enregistrer l'activité spontanée du réseau en développement.

Les indicateurs fluorescents sensibles au calcium, tels que l'URA 2:00 AM ester, contiennent des groupes acides carboxyliques capables de se lier aux ions calcium. Ces colorants fluorescents sont activés par des longueurs d'onde lumineuses spécifiques, en utilisant soit la microscopie à un photon, soit la microscopie à deux photons. Le nombre de photons émis par le colorant est temporairement modifié lors de la liaison avec le calcium.

Ce changement du nombre de photons ou de la fluorescence est indiqué comme le signal delta FF et correspond à une variation du taux de calcium dans le neurone. La mesure des variations des indicateurs sensibles au calcium constitue une méthode de lecture utile pour analyser les schémas d'activité du réseau dans les cellules en développement. Bonjour, je suis Rianna Morty, et moi, c'est Julie Abbots.

Nous appartenons au département de neurophysiologie interprétative et à l'université d'Amsterdam. Nous utilisons l'imagerie calcique pour étudier l'activité fonctionnelle dans les tissus en développement du cortex de la souris, à l'aide d'indicateurs sensibles au calcium et d'une imagerie multifocale. L'objectif de ce court métrage est de montrer comment ces méthodes peuvent être utilisées pour mesurer à la fois les activités spontanées et évoquées dans les réseaux en développement du système nerveux.

Retirer rapidement le cerveau du crâne d'une souris jeune afin de réduire les dommages au réseau neuronal. Dissecter le cerveau dans une solution froide destinée aux tranches. La solution pour tranches contient du chlorure de coline à la place du sodium couramment utilisé dans l'ASFT pour les enregistrements neuronaux.

Dans ces expériences, nous préparons des tranches cérébrales issues du cortex entéral du cerveau de souris en développement. Placez un morceau de papier filtre sur un plat de Pétri et humidifiez-le avec quelques millilitres de A TSF. Transférez le cerveau sur le morceau de papier filtre.

Bissecter les hémisphères à l’aide d’un rasoir à lame unique. Séparer les deux hémisphères. Remettre l’un d’eux dans la solution de coupe glacée avec l’hémisphère restant.

Retirer le cervelet à l’aide de la lame de rasoir. Retourner un hémisphère sur sa ligne médiane et pratiquer une incision d’environ un millimètre à partir de la surface dorsale, avec un léger angle de la lame orienté vers l’extrémité rostrale. Retourner ensuite le cerveau sur.

Utilisez un coton-tige et une spatule métallique pour couper récemment sa surface. Transférez le cerveau sur le bloc de découpe métallique. Poussez délicatement le cerveau hors de la spatule à l’aide d’un coton-tige sur la surface collée.

Des tranches de cerveau de 300 micromètres sont coupées ; pour les tissus jeunes, les vitesses de découpe et la fréquence de la lame sont généralement plus faibles que celles utilisées pour les tissus plus matures. Une fois coupées, transférez chaque tranche à l’aide d’une pipette en verre ; les tranches sont transférées dans la chambre de maintien, contenant une A CSF oxygénée à température ambiante. L’A CSF contient un rapport magnésium/calcium plus élevé que la solution A CSF.

Les tranches utilisées pour l'enregistrement sont laissées une heure pour récupérer. Pour charger les cellules avec un indicateur dépendant du calcium ou un marqueur spécifique aux cellules, les tranches doivent être transférées dans une chambre pour la procédure de marquage. Bien que des chambres commerciales soient disponibles, on peut facilement en monter une à partir d'équipements de laboratoire standards pour un coût très faible.

Pour fabriquer une chambre de coloration, vous aurez besoin du matériel de laboratoire suivant : deux boîtes de Pétri en plastique, une seringue de 10 millilitres, un morceau de tube en silicone, un insert pour culture cellulaire doté d'une membrane semi-perméable, de la colle forte, trois petits raccords pour tube et une aiguille fine. Prenez la grande boîte de Pétri et percez un petit trou à l’aide d’une tige chauffée dans la paroi latérale. Prenez la petite boîte de Pétri et faites un trou de diamètre similaire, suffisamment grand pour permettre le passage du tube en silicone.

Faire passer une section de tube en silicone à travers le trou et former une boucle à l'intérieur du petit récipient. Utiliser de la colle super glue pour sceller l'extrémité ouverte du tube. Ensuite, fixer le reste du tube sur la paroi intérieure du petit plat de Pétri.

Placer la petite boîte de Pétri au centre de la grande et la coller en place. Prendre l'extrémité restante du tube en silicone et la faire passer par le petit trou dans la paroi latérale de la boîte de Pétri. Prendre une aiguille fine et pratiquer de petits trous dans le tube en silicone à l'intérieur de la boîte de Pétri.

Réalisez les trous à des intervalles réguliers pour une fusion homogène du diffuseur. Prenez une cavité de culture cellulaire munie d'une membrane semi-perméable à l'aide d'un scalpel chauffé. Coupez le centimètre supérieur de la cavité afin d'obtenir un récipient peu profond permettant de maintenir les tranches pendant l'incubation.

Placer le plat peu profond au centre du petit plat, entouré par le tube en silicium poreux. Faire un trou d'un diamètre d'environ un demi à un centimètre dans le couvercle du grand plat. Prendre une seringue en plastique de 10 millilitres à l'aide d'un scalpel chauffé.

Effectuez une coupe en biais pour retirer l'extrémité de la seringue. Appliquez de la colle cyanoacrylate sur la surface coupée du tube de la seringue. Fixez-le directement au-dessus du trou sur le couvercle de la grande boîte de Pétri.

Fixer un raccord de tube à l'extrémité de la pointe de la seringue. Placer le plat peu profond au centre de la petite boîte de Pétri en veillant à ce que le tube à gaz poreux soit disposé autour du plat. Ce tube est ensuite relié à une source de gaz carbogène afin d'oxygéner les tranches.

Pendant l'incubation, remettez le couvercle du grand plat, qui est également relié directement à l'apport de gaz par l'extrémité de la seringue. Cela assurera un apport continu de car et de gaz sur les tranches durant l'incubation afin d'éviter la décoloration du colorant. Toutes les manipulations sont effectuées avec le moins de lumière possible, et le colorant ainsi que les tranches sont maintenus à l'abri de la lumière.

Remplissez la chambre de coloration avec environ un millilitre et demi de A TSF provenant du support de tranches. Placez la chambre d'interface à l'intérieur et ajoutez un autre millilitre de A TSF. Il est important de maintenir un bon approvisionnement en oxygène afin de préserver la santé du tissu et d'assurer un bon chargement de la tranche.

La coloration se produit à environ 35 degrés C pour faciliter l'absorption du colorant par les neurones pendant que la chambre de coloration chauffe. Préparez le colorant indicateur pour le fira 2:00 AM Ester. Ajoutez neuf microlitres de DMSO avec un microlitre d'acide onique à un flacon de 50 microgrammes.

DMSO et acide onique. Agissent comme agents perméabilisants pour permettre au colorant d'être absorbé à travers la membrane lipidique. Vortexer le flacon pendant 15 minutes afin de s'assurer que le colorant est complètement dissous.

Pour la coloration, transférez chaque coupe dans l'interface. Insérez-la dans la chambre de coloration. Appliquez directement la teinture sur la région d'intérêt située au-dessus des tranches, puis fermez le couvercle de la chambre de coloration.

Laisser les tranches incubées à l'obscurité pendant 20 à 40 minutes, selon l'âge de la souris utilisée. Après l'incubation, transférer les tranches dans le porte-tranche pour éliminer tout excès de colorant résiduel. Les protocoles de marquage pour l'imagerie calcique peuvent également être adaptés aux tissus plus âgés.

Cela nécessite une étape supplémentaire de pré-incubation. Transférez les tranches usagées dans une boîte de pré-incubation peu profonde contenant trois millilitres de LCR et huit microlitres de solution crema four à 0,5 %, chauffée à 35 degrés C pendant trois minutes. Ensuite, transférez les tranches dans l'interface, insérez-les dans la chambre de coloration et suivez les procédures de coloration habituelles.

Il est également possible de colorer ces tranches pour les cellules non neuronales, à savoir les astrocytes, les microglies et les cellules endothéliales. La rhodamine au soufre 1 0 1 peut être utilisée pour colorer les astrocytes en vue de la détection de la soufre domine. Préparez une solution de 10 micromolaire et appliquez au pipet le colorant violet sur la région d'intérêt dans les tranches.

Laisser incuber pendant une période de 15 minutes. Transférer les tranches dans la chambre de maintien afin d'éliminer tout excès de colorant. Le conjugué FSE de la lectine de tomate peut colorer les microglies et les cellules endothéliales.

Pour la lectine de tomate, préparez une solution de 20 microgrammes par millilitre. Appliquez le colorant sur la région d’intérêt dans les tranches. Laissez les tranches s’incuber pendant une période de 45 minutes.

Ensuite, transférez à nouveau les tranches dans la chambre de maintien. Pendant l'acquisition d'images, les tranches doivent être stables sous le microscope. Habituellement, un peigne métallique est placé pour maintenir le tissu en place ; toutefois, il peut déformer inégalement la surface de la tranche, ce qui limite le champ de vision net à éviter lors de l'imagerie.

Ces tranches sont fixées sur la chambre d'enregistrement à l'aide d'une solution de POLYETHALINE ou de PEI. Le PEI est un polymère utilisé pour améliorer l'attachement des cellules à une surface pendant au moins une heure. Avant de placer les tranches dans les chambres d'enregistrement, remplissez ces chambres avec quelques millilitres de solution de PEI afin de recouvrir le fond de la chambre.

Tout d'abord, rincez le PEI de la chambre avec de l'eau distillée, puis avec une solution de CSF. Transférez une tranche dans la chambre d'enregistrement et retirez l'excès de solution de CSF. Positionnez la tranche au centre de la chambre à l'aide d'un pinceau fin.

Retirez tout liquide céphalorachidien (A CSF) restant à l’aide de petits morceaux de papier filtre absorbant. Veillez à ce que la coupe n’ait plus de liquide céphalorachidien (A CSF) autour de ses bords. Enfin, ajoutez délicatement une demi-millilitre de liquide céphalorachidien (A CSF) sur la coupe sans la déloger de la chambre.

Placer les chambres dans un grand récipient d'interface oxygéné et laisser encore une heure à l'obscurité. Les variations des colorants indicateurs sensibles au calcium peuvent être enregistrées par microscopie à un ou deux photons. Nous utilisons un laser au saphir dopé au titane couplé à un microscope Olympus afin de réaliser une imagerie à deux photons dans nos réseaux neuronaux.

En outre, nous utilisons un système d'endoscope Trim Scope de L Vision Biotech équipé d'une caméra EM CCD Hammer MATSU permettant des taux de balayage de trames accrus. Placer la chambre à tranches sous le microscope avec un flux stable de A-T-S-F-A-T-S-F oxygéné contenant 1,6 millimolaire de calcium et 1,5 millimolaire de magnésium. La solution est chauffée à environ 30 degrés C dans le montage en utilisant une lumière blanche.

Localisez la région d'intérêt dans la coupe et focalisez sur la surface. Éteignez les lumières et fermez la porte de l'armoire d'enregistrement afin de réduire les niveaux de lumière de fond.

De nombreux logiciels commerciaux ou open source différents sont disponibles pour enregistrer et analyser les images. Dans notre laboratoire, nous utilisons le logiciel inspector de Lavis Biotech. Pour commencer l'acquisition d'images, sélectionnez le mode caméra CCD pour la détection. Réglez la longueur d'onde appropriée pour votre indicateur.

Pour FIRA 2:00 AM Ester, réglez l'excitation à 820 nanomètres dans le logiciel du microscope trim. Sélectionnez le mode de balayage 64 B. Choisissez la taille optimale du champ de vision et la résolution en pixels adaptées à votre région d'intérêt.

Sélectionnez une fréquence d'images appropriée et activez la rotation des pixels si nécessaire pour votre échantillonnage d'images. Ouvrez l'obturateur du laser pour commencer l'acquisition d'images en continu. Utilisez le mode d'acquisition en continu.

Réglez le gain et l'intensité du laser, puis focalisez-vous sur le réseau neuronal que vous souhaitez imager. Arrêtez la numérisation. Sélectionnez les paramètres de prise de vue en laps de temps pour la fréquence d'images et la durée de la séquence.

Après l'acquisition d'images en laps de temps, réalisez un empilement en Z d'images marquant 20 micromètres au-dessus et 20 micromètres en dessous par pas d'un micromètre. Cet empilement en Z est utilisé pour la détection des cellules lors de l'analyse. Exportez les fichiers enregistrés sous forme d'une pile d'images TIFF.

En conclusion, nous avons montré l'utilisation d'indicateurs calciques pour mesurer l'activité spontanée synchrone au sein du réseau cortical en développement. Des informations plus détaillées sur la méthodologie et les réactifs sont disponibles dans les fiches techniques accompagnant ce film, afin de vous permettre de mettre en place cette technique dans votre propre laboratoire.