Confirmation des voies métaboliques et la découverte par ¹³ C-étiquetage des acides aminés protéinogènes

L'objectif de ce protocole est d'étudier le métabolisme bactérien à l'aide d'une analyse du métabolisme assistée par le carbone 13. Pour commencer, les micro-organismes sont cultivés en présence de substrats carbonés marqués, qui s'incorporent aux protéines microbiennes. Les micro-organismes sont ensuite récoltés, et les acides aminés sont extraits, hydrolysés et dérivés.

Les échantillons sont appliqués à un chromatographe en phase gazeuse couplé à un spectromètre de masse, ou CP-SM. En suivant les parcours de transition des atomes entre les métabolites au sein du réseau biochimique, on peut déterminer les voies métaboliques fonctionnelles utilisées par le microbe. Je suis Bert Burla.

La méthode que nous présentons ici peut être utilisée comme complément de la transcriptomique et de la protéomique pour déterminer les voies métaboliques chez les micro-organismes. Nous avons utilisé cette technique pour étudier des micro-organismes photosynthétiques tels que les cyanobactéries, en ce qui concerne l'utilisation du carbone myotrophique ou hétérotrophique. Dans cette vidéo, nous utiliserons la souche modèle ANOTHE 5 1 1 42 afin de démontrer l'utilisation de substrats carbonés marqués pour découvrir de nouvelles fonctions enzymatiques.

La démonstration de la procédure sera effectuée par moi-même, Li Yu et Chu Yang Fang. Commencer cette procédure en cultivant des bactéries Cyanothece dans un milieu non marqué. Lorsque les bactéries atteignent la phase de croissance logarithmique moyenne, ensemencer 3 % en volume dans un milieu marqué au carbone 13.

Ensuite, afin d'éviter l'introduction de carbone non marqué provenant de la sous-culture initiale de l'inoculum dans le même milieu marqué au stade de croissance logarithmique intermédiaire. Lorsque les bactéries Cy Thesei marquées au carbone 13 atteignent la phase de croissance logarithmique intermédiaire, récoltez 10 millilitres par centrifugation. Resuspendez le culot dans 1,5 millilitre d'acide chlorhydrique à six molaire et transférez-le dans un flacon transparent pour chromatographie en phase gazeuse (CPG) à visser.

Fermer les flacons et les placer dans un four à 100 degrés Celsius pendant 24 heures afin d'hydrolyser les protéines de la biomasse en acides aminés. L'hydrolyse des pastilles de biomasse permet d'obtenir 16 des 20 acides aminés courants. Transférer la solution d'acides aminés dans des tubes microcentrifugeurs de deux millilitres, puis centrifuger à 20 000 Gs pendant cinq minutes. Après hydrolyse, transférer la solution d'acides aminés dans des tubes microcentrifugeurs de deux millilitres, puis centrifuger à 20 000 Gs pendant cinq minutes afin de faire déposer les particules solides.

Après la centrifugation, transférez les surnageants dans de nouveaux flacons de chromatographie en phase gazeuse (CPG) afin d'éliminer les particules solides présentes dans la solution d'hydrolyse, pour éviter qu'elles n'entrent dans la colonne de CPG. Ensuite, les acides aminés sont dérivés afin de les rendre volatils pour leur séparation par chromatographie en phase gazeuse : dissolvez les échantillons séchés avec 150 microlitres de tétrahydrofuranne, THF, et 150 microlitres de tert-butyl diméthylsiloxy et de méthyltrifluoro.

Acétamide, réactif de dérivation T-B-D-M-S : incuber tous les échantillons dans un four entre 65 et 80 degrés Celsius pendant une heure. Vortexer occasionnellement les échantillons afin de s'assurer que les métabolites présents dans le flacon sont bien dissous. Centrifuger les échantillons à 20 000 ×g pendant 10 minutes, puis transférer le surnageant dans de nouveaux flacons pour chromatographie en phase gazeuse.

Le surnageant doit être une solution limpide de couleur jaunâtre. Les températures de la GC sont les suivantes : maintenir à 150 degrés Celsius pendant deux minutes. Augmenter de trois degrés Celsius par minute jusqu'à 280 degrés Celsius.

Augmenter de 20 degrés Celsius par minute jusqu'à 300 degrés Celsius, puis maintenir pendant cinq minutes. Ensuite, pour une colonne de chromatographie en phase gazeuse (CPG) de 30 mètres, régler le délai de solvant à environ cinq minutes et la plage du rapport masse sur charge entre 60 et 500. Analyser les échantillons par CPG-SM en utilisant un volume d'injection avec un rapport de partage de un à cinq ou de un à 10 de un microlitre et un gaz vecteur, l'hélium, à 1,2 millilitre par minute, après l'analyse.

Analyser les données de GCMS à l'aide de Microsoft Excel. Le temps de rétention en chromatographie gazeuse et les pics uniques de rapport masse sur charge propres à chaque acide aminé sont illustrés dans cette figure. T-B-D-M-S. Les dérivés d'acides aminés sont généralement clairement séparés par spectrométrie de masse en deux fragments chargés : le fragment M moins 57, qui contient l'intégralité de l'acide aminé, et le fragment M moins 159, qui ne possède pas le groupe carboxyle alpha de l'acide aminé, pour la leucine et l'isoleucine.

Le pic M moins 57 était superposé à d'autres fragments de pics de masse. Le groupe N moins 15 peut être utilisé pour analyser l'étiquetage complet des acides aminés. De plus, le groupe F 3 0 2 est souvent détecté dans la plupart des acides aminés, et il contient uniquement le premier groupe carboxyle alpha et les deuxièmes carbones du squelette d'un acide aminé.

Cependant, comme ce pic Ms.Peak présente souvent des rapports bruit/signal élevés, F 3 0 2 n'est pas recommandé pour l'analyse quantitative des flux métaboliques. La dérivation des acides aminés ou des métabolites centraux introduit des quantités importantes d'isotopes naturellement marqués, notamment du carbone 13, de l'oxygène 18, du silicium 29 et du silicium 30. Le bruit de mesure dû aux isotopes naturels dans le spectre d'isotopes de masse brut peut être corrigé à l'aide de logiciels publiés.

Les données finales de marquage isotopique sont rapportées sous forme de fractions massiques. Par exemple, M zéro, M1, M deux, M trois et M quatre, représentant des fragments contenant de zéro à quatre atomes de carbone marqués au carbone 13. Ce 5 1 1 2 ne contient pas l'enzyme thréonine ammonia lyase, qui catalyse la conversion de la thréonine en α-cétobutyrate dans la voie typique de synthèse de l'isoleucine.

Par conséquent, afin de déterminer la voie métabolique de l'isoleucine chez cet organisme, Cyana THESEI 5 1 1 42 a été cultivé dans un milieu ASP deux contenant 54 millimolaire de glycérol et analysé par GCMS comme décrit dans cette vidéo et illustré ici. Cyana Thesei 5 1 1 4 2 utilise du glycérol marqué en position secondaire comme principale source de carbone, et nous avons observé que la thréonine et l'alanine, dont le précurseur est le pyruvate, possèdent un carbone marqué, tandis que l'isoleucine est marquée avec trois carbones. Ainsi, la synthèse de l'isoleucine chez Cyana Thesei 5 1 1 4 2 ne peut pas provenir de la voie thréonine utilisée par la plupart des organismes. En revanche, la leucine et l'isoleucine présentent des profils de marquage identiques, basés sur les fragments M moins 15 et M moins 1 59.

Par exemple, l'isotope ou les données issues de l'azote 15 contenant des acides aminés NON FRAGMENTÉS ont montré un marquage identique pour la leucine et l'isoleucine. Ainsi, la leucine et l'isoleucine doivent être synthétisées à partir des mêmes précurseurs, à savoir le pyruvate et l'acétyl-CoA. Cette observation est compatible avec le passage des atomes de carbone marqués dans la voie du citramalate pour la synthèse de l'isoleucine.

Cette méthode peut être utilisée pour étudier le métabolisme d'une grande diversité de micro-organismes, et une fois maîtrisée, elle peut être réalisée du début à la fin en environ une semaine.