Cartographie Diffusion moléculaire dans la membrane plasmique par multiple-cible de Recherches (MTT)

Bonjour. Dans cette vidéo, nous présentons une expérience complète de suivi quantique individuel. Un algorithme dédié a été entièrement conçu en collaboration avec des experts en imagerie du centre ISIS. Au cours de cette vidéo, nous utiliserons le récepteur du facteur de croissance épidermique comme modèle pour décrire la méthode de cette technique.

Le récepteur du facteur de croissance épidermique est une protéine transmembranaire. Ce récepteur sera marqué à l’aide d’un anticorps monoclonal, réduit de manière à ne conserver que le fragment Fab. Le fragment Fab est biotinylé, puis lié à la streptavidine du point quantique ; ce système permettra de reconnaître précisément le récepteur EGF.

Notre objectif est de fournir une vue complète de la dynamique des récepteurs de surface cellulaire. En effet, les trajectoires moléculaires peuvent s'écarter d'une diffusion brownienne en étant confinées au sein de nano-domaines. Par exemple, ceci peut constituer l'indice d'une interaction sous-jacente avec, par exemple, des partenaires de signalisation ou des échafaudages moléculaires.

Nous visons à décrire exhaustivement de tels événements en les cartographiant sur l'ensemble de la cellule, ce qui nécessite de travailler avec une haute résolution temporelle SPECT ainsi qu'une densité de marquage élevée. Nous appelons donc cette approche le traçage multipolaire. La première étape de l'expérience consiste en la préparation de l'échantillon.

Nous travaillons sur des cellules vivantes avec ou sans antibiotiques. Ici, nous utilisons sept cellules, qui expriment de manière endogène des récepteurs EGF. Après avoir détaché la cellule, nous devons confirmer précisément afin d'avoir le même nombre de cellules par puits de la plaque.

Un nombre précis de cellules est très important pour augmenter la prévisibilité du nombre de points quantiques par cellule. Après avoir distribué les cellules dans le puits H, vous devez incuber la plaque pendant 24 heures à 37 degrés avec 7 % de CO2. L'étape suivante consiste à préparer les points quantiques couplés à des anticorps. Les points quantiques sont de petites nanoparticules fluorescentes.

Ces particules présentent un intérêt très élevé ici, car elles sont beaucoup plus brillantes et stables par rapport aux sondes fluorescentes classiques et au signal. Le rapport signal sur bruit est très important pour ce type d'expérience. Dans ce cas, nous utilisons un milieu complet pour saturer les espaces autour des points quantiques et prévenir l'agrégation.

Après cela, nous avons mis en présence les points quantiques dans la protéine bioTE ou les anticorps d'intérêt selon un rapport un pour un afin d'obtenir statistiquement davantage de points quantiques monovalents. Dans cette expérience, nous utilisons un fragment Fab dirigé contre le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGF), produit en laboratoire à partir d'anticorps monoclonaux et marqué par la biotine. Pendant l'incubation d'environ 15 minutes, vous pouvez maintenir le contrôle de l'agrégation et de l'homogénéité à l'aide d'un agitateur à 1 200 tours par minute et à 25 degrés.

Lorsque le mélange est prêt, vous pouvez l'ajouter sur vos cellules. Retirez très doucement le milieu du puits afin d'éviter le détachement des cellules et ajoutez la quantité nécessaire de mélange pour votre expérience. Dans ce cas, nous ajouterons 100 microlitres de mélange par puits.

Après l'ajout du mélange, vous pouvez incuber vos cellules pendant 15 minutes. Dans ce cas, à 37 degrés avec 7 % de CO2. Après cette incubation, vous pouvez observer un grand nombre de doubles points fréquents en suspension dans le milieu.

Ces points quantiques doivent être éliminés avant l'imagerie. En raison du bruit que nous introduisons. C'est pourquoi nous devons rincer chaque fois, ou plutôt plusieurs fois dans ce cas, cinq fois pour vous rincer.

Utilisez un milieu d'imagerie sans autofluorescence. Ici, nous utilisons un tampon HBSS avec aps. Vos cellules sont maintenant prêtes.

Il est temps de passer au dispositif d'acquisition. Le dispositif est composé de quatre éléments principaux : un microscope inversé, une caméra sensible à la lumière, une lampe à mercure puissante et un incubateur permettant de maintenir les cellules à 37 degrés. La lumière provenant de la lampe à mercure traverse une fibre optique et une roue à filtres avant d'illuminer l'échantillon.

La fluorescence de l'échantillon est filtrée et collectée par une caméra E-M-C-C-D située à gauche. Nous utilisons actuellement des objectifs à immersion huile d'ouverture numérique 1,3 et 1,49. L'étape centrale de cette expérience est l'acquisition elle-même.

Une fois les cellules en cours de focalisation, nous examinons une cellule représentative présentant un marquage intense. Dans le cas des points quantiques, nous acquérons d'abord une image unique en lumière blanche transmise, qui pourra ultérieurement servir à vérifier l'aspect de la cellule et la limite spécifique des podia LA. Ensuite, nous acquérons une vidéo généralement à une fréquence de 36 millisecondes, la fréquence la plus rapide autorisée en mode image complète.

Nous utilisons un CCD à multiplication électronique pour atteindre une sensibilité au niveau de la molécule unique avec un rapport signal sur bruit suffisant, au moins supérieur à 20 décibels. Généralement autour de 25 décibels, nous acquérons habituellement 300 images. Pour évaluer un jeu de données donné, vous devez simplement fournir le chemin d'accès au répertoire contenant les fichiers vidéo.

Ensuite, en tapant la commande, le texte se reconnecte dans MetLab ou la commande MTT 23 I, qui affiche d'abord une interface graphique listant tous les paramètres utilisés pour démarrer l'analyse entièrement automatisée. L'analyse principale MTT est effectuée sur chaque image, en invoquant trois tâches principales : la détection, pour chaque pixel, de la présence ou de l'absence d'un quantum cible.

Ensuite, pour chaque détection, estimation des paramètres pertinents de la cible, tels que sa position en pixels, l'intensité du signal, etc. Enfin, reconnexion des nouvelles cibles avec les trajectoires déjà construites à partir des images précédentes pour chaque pixel.

En considérant une sous-région locale, nous comparons deux hypothèses de présence, soit uniquement du bruit, soit un signal. Grâce à la fonction d'étalement du point, ModuLite présente un pic hin. Nous utilisons un seuil garantissant un taux de fausses alarmes suffisamment faible, avec moins d'une détection par erreur par image pour chaque cible détectée.

Nous effectuons ensuite une estimation par moindres carrés des pieds de nutriments fantômes afin de déterminer la largeur et la hauteur de la position du Goshen détecté. Cela fournit notamment la position précise de la cellule spic du colorant, avec une exactitude typique de 10 à 20 nanomètres pour des rapports signal sur bruit courants. Toutefois, à forte densité, les pics peuvent souvent être trop proches les uns des autres, et les pics plus intenses peuvent masquer les pics les plus faibles. Pour y remédier, nous appliquons une déflation aux pics détectés à partir de l'image initiale.

Encore une fois, la détection sur le résidu peut typiquement réintroduire 10 % des pics. Parvenir à une détection presque exhaustive est très utile pour une reconnexion précise. Ensuite, l'ensemble des nouvelles cibles est apparié à l'ensemble des trajectoires précédentes pour cet élément.

Afin d'attribuer chaque trajectoire à une cible, si possible, et de prendre en compte les éventuels clignotements, nous utilisons l'ensemble des informations statistiques disponibles obtenues lors de l'étape de détection. Ainsi, les cibles ne sont pas simplement attribuées à la trajectoire la plus proche. En cas de conflit, lorsque des trajectoires peuvent se croiser, ce qui signifie que leurs régions respectives de recherche se chevauchent, nous prenons en considération les valeurs statistiques d'intensité, de vitesse, de largeur et de clignotement, tant pour les trajectoires que pour les cibles.

Ceci fournit le score de reconnexion statistiquement optimal. La stratégie permet d'éviter, lorsque possible, un biais de la reconnexion vers les voisins les plus proches, c'est-à-dire vers le mouvement le plus lent. Nous utilisons ensuite une fonction pour évaluer une éventuelle confinement transitoire au sein des trajectoires.

Cette fonction est inversement liée à la diffusion locale, comme établi par Sexton Simpson et ses collaborateurs. L'application d'un seuil permet de définir des épisodes de confinement ou non. En itérant l'ensemble des trajectoires, on peut finalement cartographier la dynamique membranaire en termes de confinement transitoire, de preuves de ralentissement, et cela peut être représenté.

Alternativement, en utilisant les valeurs binaires ou discrètes de cet indice de confinement, MTT effectuera automatiquement ces tâches par défaut, enregistrant pour chaque vidéo les paramètres bruts de chaque pic dans un fichier eski, et permettant des analyses avancées ultérieures. Les résultats typiques, tels que la carte des trajectoires sur chaque cellule et les histogrammes des paramètres d'intérêt — intensités des pics, rapport signal sur bruit, valeurs locales déficientes, etc. — peuvent également être facilement adaptés à toute étude spécifique. Cette vidéo résumera maintenant les résultats typiques obtenus par MTT.

Une partie importante du travail consiste à élaborer l'algorithme, qui pourrait devoir être adapté à des investigations spécifiques telles que les modes de mouvement atypiques ou les interactions. Toutefois, l'utilisation de MTT est très simple. Les utilisateurs doivent uniquement optimiser quelques paramètres, comme les limites spatiales et temporelles.

Lors de l'élaboration de la MTT, nous avons cherché à repenser complètement les options analytiques utilisées pour chaque tâche. Nous optimisons le processus selon deux axes difficiles. Premièrement, traiter des densités élevées afin d'obtenir la meilleure information spatiale possible sur la surface, et deuxièmement, gérer un faible rapport signal sur bruit (SNR), ce qui permet généralement de travailler à faible photoblanchiment et à haute vitesse ; la restriction de mouvement peut alors être interprétée comme la signature d'une interaction sous-jacente.

Les récepteurs membranaires peuvent interagir avec le cytosquelette sous-membranaire ou avec des domaines pro-lipidiques, par exemple. De tels événements peuvent être étudiés à travers des variations de confinement dans l'espace et dans le temps. Les mesures dynamiques peuvent être comparées à des approches complémentaires telles que les FRA F Cs ou le freight.

Le code source ouvert est disponible pour la recherche académique. Il peut être téléchargé depuis notre page web sur CML point univ if an S fr, sur la page de notre équipe, qui fournit un lien pour le téléchargement. Les industriels intéressés sont également invités à nous contacter.

Nous tenons à remercier chaleureusement les membres de notre équipe et des plateformes communes pour leur soutien et leurs discussions fructueuses. Ce projet est financé par le CNRS dans le cadre du MAA University Pac Region National de La, et la Fondation Médicale est soutenue par la ligue des contrôleurs. Merci d'avoir regardé.