Reproductible écrasement du nerf sciatique de souris et l'évaluation subséquente de la régénération par l'analyse du Mont muscle entier

L'objectif général de cette procédure est de démontrer une méthode simple et reproductible de compression du nerf sciatique et d'analyse en montage entier de la réinnervation musculaire après la compression du nerf sciatique. Cela est réalisé en exposant d'abord le nerf sciatique, y compris en positionnant correctement les rétracteurs chirurgicaux afin d'assurer un bon accès au nerf. Ensuite, comprimez le nerf à l'aide de pinces hémostatiques et marquez-le au charbon.

Ensuite, retirer les muscles individuels innervés par le nerf sciatique du membre postérieur. La dernière étape consiste à disséquer les muscles individuels pour une analyse en montage complet après immunomarquage. En définitive, les résultats montrent qu'une compression reproductible du nerf sciatique peut être réalisée facilement et que des montages complets de muscles peuvent être utilisés pour analyser la régénération ultérieure.

Le principal avantage de cette procédure est qu'elle fournit une technique simple et reproductible pour écraser le nerf sciatique et évaluer ultérieurement la régénération axonale. Commencez cette procédure par l'anesthésie de la souris destinée à la chirurgie, à l'aide d'un cocktail composé de 100 milligrammes par kilogramme de kétamine et de 10 milligrammes par kilogramme de xylazine, administré par injection intrapéritonéale afin de minimiser la douleur postopératoire. La souris reçoit également une injection sous-cutanée de 10 milligrammes par kilogramme de méloxicam.

Ensuite, rasez soigneusement les deux flancs à l’aide d’un rasoir chirurgical. Appliquez ensuite une crème dépilatoire pour épiler complètement les narines. Nettoyez la peau avec un applicateur stérile à embout cotonné et un antiseptique chirurgical à base de Bétadine.

Ensuite, appliquer une pommade ophtalmique sur les yeux à l’aide d’un applicateur stérile à embout cotonneux. Placer la souris sur une plaque en acier inoxydable propre, elle-même placée sur une couverture thermique préchauffée, et maintenir la température de l’animal à 37 degrés Celsius. Puis fixer toutes les pattes avec du ruban adhésif.

Positionnez soigneusement la patte postérieure de manière symétrique afin que l'articulation du genou forme un angle droit avec le corps. Ensuite, recouvrez le champ opératoire d'un champ stérile sous le microscope. Pratiquez une incision semi-circulaire en traversant la ligne médiane.

Séparez délicatement la peau de la musculature sous-jacente et repliez-la de temps en temps. Appliquez environ 0,1 millilitre de sérum physiologique stérile pour maintenir le site chirurgical humide pendant l'intervention. Ensuite, ouvrez le plan fascial entre le grand fessier et la tête antérieure du biceps fémoral.

Pour mettre à nu le nerf sciatique à des fins de contrôle chirurgical. Le nerf sciatique controlatéral doit être exposé et mobilisé, mais laissé intact. Ensuite, remettre en place et suturer la musculature glutéale.

Exposer le nerf sciatique expérimental de la même manière à l'aide de rétracteurs. Pour faciliter la visualisation, libérer délicatement le nerf sciatique des tissus conjonctifs environnants à l'aide d'une paire de ciseaux d'iridectomie.

Ensuite, utilisez la pince fine 5 45 pour placer le nerf au niveau de la mâchoire inférieure de la pince hémostatique extrafine, en alignant les trois faisceaux adjacents les uns aux autres, sans les superposer. La pince hémostatique porte une marque gravée à 1,5 millimètre de son extrémité. Placez la portion la plus externe du sciatique alignée avec cette marque avant la compression.

Cela garantit une écrasement d'une largeur uniforme et empêche le nerf de dépasser des mâchoires des pinces hémostatiques lorsqu'il est aplati sous l'effet de la force d'écrasement. Si le nerf dépasse des extrémités des pinces, il ne sera que partiellement écrasé. Utilisez une deuxième paire de pinces hémostatiques préalablement trempée et recouverte de carbone en poudre pour marquer le site d'écrasement.

Écraser le nerf au même site d’écrasement pendant 15 secondes à trois clics. Aucun marquage au carbone ne doit s'étendre au-delà de la limite du premier écrasement. Cela est particulièrement important si un marquage précis du site d’écrasement est requis : il faut alors tremper préalablement la pince dans du carbone afin d'éviter une dispersion généralisée du carbone sur le site chirurgical.

Ouvrir la pince dans le carbone en poudre. Puis la refermer délicatement. Utiliser un champ de gaze stérile pour essuyer le carbone à l'extérieur de la pince hémostatique.

Examinez la pince sous au moins trois fois le grossissement pour vérifier que les surfaces de broyage sont uniformément recouvertes de carbone en poudre. Si nécessaire, replongez-les et essuyez-les. Refermez et suturerez le muscle glutéal de la même manière que du côté controlatéral. Enfin, fermez l'incision cutanée à l'aide des agrafes réflexes de neuf millimètres.

Si les pinces réflexes de neuf millimètres s'avèrent restrictives pour les mouvements, des pinces réflexes plus petites ou six fils de suture aut peuvent être utilisées. Ensuite, après avoir sacrifié la souris, retirer quatre muscles : le tibial antérieur, l'extenseur long des orteils, le péronier long et le muscle soléaire de l'arrière-train, avec précaution en les épinglant par leurs tissus conjonctifs sur une boîte de Petri noire recouverte de cire.

Ensuite, rincez-les dans du PBS. Fixez-les ensuite dans du paraformaldéhyde 4 % pendant 30 minutes. Pour disséquer chaque muscle dans une boîte de Pétri noire recouverte de sard, retirez les tendons à l’aide de ciseaux d’iridectomie.

Ensuite, amincir les muscles en éliminant soigneusement les fibres musculaires internes. Préserver attentivement la surface externe du muscle, y compris les bandes de plaque motrice. Puis monter les muscles obtenus sur des lames positives avec un réactif de protection Vector et des couvre-objets en verre de 22 par 40 millimètres, en scellant deux côtés avec du vernis incolore. Une fois correctement montés sur la lame, les bandes de plaque motrice doivent être en contact avec les couvre-objets.

Voici un exemple de site de compression in situ au niveau du membre hind gauche. Le site de compression est indiqué par du carbone noir. L'astérisque marque une branche du nerf tibial qui innerve la musculature de la cuisse et sert de repère utile.

Lors de la chirurgie par écrasement, la branche tibiale du nerf sciatique est délimitée en bleu, la branche péronière en vert et la srel en jaune. Cette coupe semi-mince illustre un écrasement complet réalisé à l’aide d’une pince hémostatique. Les flèches indiquent ici les fibres écrasées.

Une écrasement incomplet réalisé avec la pince angulaire est indiqué dans une autre section semi-fin. Les pointes de flèches indiquent à nouveau les fibres écrasées, tandis que les flèches indiquent les axones préservés. Il s'agit des images rendues provenant des muscles montés entiers.

Après l'élimination du tissu conjonctif et un amincissement ultérieur, les bandes nplate sont délimitées sur chaque muscle. On observe ici le muscle entier en montage sous-jacent. 14 jours après la section du nerf sciatique.

Les flèches indiquent les zones de la jonction neuromusculaire qui ont été réinnervées par un axone. Voici la démonstration d'une jonction neuromusculaire dénervée. Les prolongements cellulaires de cellules de Schwann positifs pour la GAP-43 sont indiqués par les pointes de flèche.

Aucun axone n'est visible à cette jonction neuromusculaire dénervée. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment écraser de manière reproductible un nerf statique et préparer des montages de muscles innervés pour l'analyse de la régénération.