Microcapsules d'alginate comme une plate-forme 3D pour la Propagation et différenciation des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) à différentes lignées

Ce protocole est optimisé pour encapsuler des cellules souches embryonnaires humaines pluripotentes et les différencier en neurones dopaminergiques dans un système 3D. Tout d'abord, traitez les colonies avec un inhibiteur de ROCK ou RI et dissociez-les en cellules individuelles à l’aide d’acuate mélangé à de l’alginate de sodium, puis faites-les passer à travers le dispositif d’encapsulation. Poursuivez le traitement avec le RI pendant trois jours, transférez les cellules encapsulées sur des cellules PA six et différenciez-les pendant 28 jours.

En fin de compte, l'analyse de l'expression des gènes et des protéines montre une efficacité accrue dans la génération de neurones dopaminergiques. Le principal avantage de cette technique particulière par rapport au protocole de différenciation 2D existant réside dans le fait que nous cherchons à propager et à différencier ces cellules dans un environnement 3D, lequel environnement 3D offre la possibilité de propager les cellules de manière très dense. Cela permet également d'améliorer les interactions entre cellules durant la différenciation.

Et troisièmement, offrir également une meilleure efficacité de différenciation par la suite. De plus, si je puis ajouter que cette technique particulière peut également être adaptée à d'autres types de cellules que nous pouvons propager dans un environnement tridimensionnel. N'oubliez pas également, par exemple, que cette technique a été optimisée en utilisant un inhibiteur de ROCK particulier qui empêche l'apoptose cellulaire et prévient le détachement des cellules des boîtes de culture.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés au début, car cette technique n'est pas couramment pratiquée en culture tissulaire. La technique d'encapsulation suivante a été optimisée à partir des études résumées par le Dr Dean et le Dr Chad sur l'application de l'alginate de type inhibiteur R, la concentration d'alginate et les paramètres du dispositif d'encapsulation. Jamie et Kim, un étudiant en doctorat de notre laboratoire, vont maintenant démontrer ce protocole.

Ajouter 25 millilitres de solution stérile de gélatine 0,1 % à 275 milligrammes d'alginate de sodium purifié dans un tube stérile de 50 millilitres et agiter au vortex pour dissoudre partiellement la poudre d'alginate. Ensuite, placer le tube sur un mélangeur orbital à 10 fois G pendant la nuit. Puis ajouter du chlorure de sodium stérile 9 % à la solution d'alginate.

Vortexez pendant 30 secondes, puis centrifugez à 95 ×g pendant cinq minutes. Conservez la solution d'alginate à quatre degrés Celsius. Dans un premier temps et dans un environnement sombre, prétraitez les cellules souches embryonnaires humaines avec un milieu de culture enrichi de 10 micromolaire d'inhibiteur de ROCK.

Incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Laver maintenant les cellules deux fois avec du DPBS pour détacher les cellules de manière enzymatique. Ajouter de l'accutane et incuber pendant 10 minutes.

À 37 degrés Celsius, récoltez délicatement les cellules à l’aide d’un grattoir à cellules et transférez-les dans un tube de 15 millilitres. Neutralisez l’Accutane avec un volume équivalent de milieu SL. Ensuite, faites passer les cellules neutralisées à travers un filtre de 40 microns dans un nouveau tube de centrifugeuse de 50 millilitres.

Utilisez maintenant un hémocytomètre pour dénombrer les cellules. Faites un culot de cellules par centrifugation, jetez soigneusement le surnageant. Lavez ensuite les cellules une fois avec du milieu préchauffé.

Chlorure de sodium à 0,9 %. Centrifuger votre prélèvement et éliminer le surnageant. Pour encapsuler les cellules souches embryonnaires humaines, commencez par resuspendre les cellules dans une solution d'alginate préchauffée.

Pour ce faire, fixez une seringue de 20 millilitres à un tube en plastique souple et aspirez de l'alginate dans la seringue. Mélangez ensuite doucement la suspension cellulaire à l’aide de la seringue sans créer de bulles. Aspirez maintenant les cellules dans la seringue.

Jetez le tube en plastique, puis fixez la seringue à la machine d'encapsulation. Passez à la mise en place des instruments du générateur de billes, de la pompe à seringue, du débitmètre d'air et du bain de précipitation au chlorure de calcium. Vérifiez qu’un espace de 10 centimètres sépare l’extrémité de la machine d'encapsulation du point de collecte dans la boîte de Pétri.

Ensuite, régler la pompe à seringue à 10 millilitres par heure. Débit d'air à huit litres par minute et une pression de 100 kilopascals. Recueillir les cellules encapsulées dans un bain de précipitation préchauffé pendant sept minutes.

Transférez-les ensuite par aspiration douce dans un tube de centrifugation de 50 millilitres contenant 20 millilitres de chlorure de sodium à 0,9 % ; laissez les capsules se déposer au fond du tube, jetez délicatement le surnageant, puis effectuez un lavage avec du chlorure de sodium à 0,9 %. Procédez ensuite à la resuspension des cellules encapsulées dans un milieu de culture préchauffé, enrichi d’un inhibiteur ROCK. Transférez dans un flacon de culture et incubez pendant trois jours.

Ensemencer les cellules de la lignée stromale murine PA6 dans un flacon T75 revêtu de gélatine à 0,1 % et conditionner le milieu de différenciation neuronale dopaminergique pendant 24 heures. Transférer les capsules dans un tube de centrifugation de 50 millilitres et les laisser décanter au fond du tube. Éliminer le surnageant et resuspendre les capsules dans le milieu de différenciation neuronale dopaminergique conditionné par les cellules PA6.

Culture en milieu. Les cellules souches embryonnaires humaines encapsulées avec la monocouche de cellules PA6 pendant 21 jours. Lors du renouvellement du milieu, changer le milieu.

Seulement la moitié du milieu chaque fois continue à cultiver les cellules PA6 en différenciation neuronale dopaminergique. Incuber dans un milieu supplémenté avec des facteurs inducteurs pendant une semaine. Aspirer d'abord les capsules et les transférer dans un tube centrifuge de 15 millilitres.

Lorsque les capsules sont descendues au fond, éliminez le surnageant. Effectuez deux lavages avec du DPBS en éliminant le surnageant à chaque fois. Ajoutez ensuite cinq millilitres de solution de décapsulation et mélangez soigneusement la suspension.

Incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Après centrifugation du culot, récupérez les cellules décapitées et lavez-les deux fois avec du DPBS, puis utilisez les cellules décapitées soit en culture en couche unique, soit pour une analyse en aval immédiate. Dans une préparation typique, le diamètre des microcapsules d'alginate se situe entre 400 et 500 microns.

Ici, test C-F-D-A-P-I. Les résultats permettent de déterminer les cellules encapsulées vertes et viables à 80 %. Des analyses de viabilité, de prolifération et d'apoptose de cellules souches embryonnaires humaines encapsulées à différents points temporels servent à optimiser les conditions de culture. Fait intéressant, les effets de l'inhibiteur de rock empêchent l'apoptose induite par la dissociation et préservent la viabilité cellulaire, avec une indication d'une croissance supérieure des cellules souches embryonnaires humaines encapsulées cultivées dans le milieu H-F-F-C-M complémenté de ri.

Cet exemple applique l'encapsulation cellulaire comme une plateforme tridimensionnelle pour différencier des cellules souches embryonnaires humaines encapsulées en neurones dopaminergiques. Comme prévu, la taille des corps embryonnaires augmente avec le temps ; après deux à trois jours de culture, les cellules décapsulées présentent une morphologie neuronale progressive avec une viabilité supérieure à 90 %. L'analyse de l'expression génique indique une régulation à la baisse du marqueur de pluripotence OCT4.

Importamment, le marqueur des progéniteurs neuronaux PAC six et le marqueur des neurones dopaminergiques th restent surexprimés après sept jours de différenciation. Des cellules souches embryonnaires humaines davantage différenciées indiquent plus de 90 % de neurones positifs pour TH après 21 jours. L'analyse par immunobuvardage en absence confirme les profils d'expression favorables de TH et de PAC six dans des systèmes de culture cellulaire en 3D par rapport à ceux en 2D.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée efficacement en deux heures. N'oubliez pas de traiter les cellules avec l'inhibiteur de ROCK avant et après l'encapsulation. Des inducteurs ou inhibiteurs variés peuvent adapter le protocole de différenciation en 3D pour des expériences futures.

Cette technique particulière consiste à encapsuler les ESL humaines et à les différencier dans un environnement tridimensionnel en vue de leur utilisation potentielle en thérapie cellulaire pour un certain nombre de maladies, en particulier la maladie de Parkinson.