Evaluation de l'expression de GFP et viabilité en utilisant le Tali Image Based Cytomètre

Ce vidéo montre une procédure permettant de déterminer la viabilité cellulaire dans des cellules exprimant la GFP à l’aide du cytomètre imageant Tally. Les cellules transduites avec la GFP sont marquées à l’aide du kit de viabilité Tally Dead Cell Red, qui colore en rouge toutes les cellules mortes grâce à l’iodure de propidium. Les cellules sont pipetées dans une lame d’analyse cellulaire Tally puis chargées dans le cytomètre, qui acquiert et analyse des images en champ clair ainsi qu’en fluorescence rouge et verte. Des histogrammes sont ensuite générés pour afficher le nombre de cellules, la taille cellulaire, l’intensité de fluorescence de l’iodure de propidium (PI) et l’intensité de fluorescence de la GFP, par comparaison avec la cytométrie en flux traditionnelle.

Tali peut fournir des données similaires concernant la viabilité cellulaire et l'expression. Toutefois, cette cytométrie basée sur l'image offre des informations visuelles supplémentaires sur la population cellulaire analysée. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la cytométrie en flux ou la microscopie à fluorescence, est que le cytomètre image Tali fournit simultanément des informations quantitatives et visuelles sur votre échantillon cellulaire.

En outre, l'instrument de comptage est plus facile à utiliser, moins coûteux et occupe moins d'espace qu'un cytomètre en flux ou qu'un microscope à fluorescence. Cela permet aux chercheurs d'effectuer rapidement des dosages quantitatifs, tels que la viabilité, sur des cellules exprimant la GFP directement sur la paillasse. Dans cette procédure, des cellules U2 OS à une concentration de 1 × 10⁶ cellules par millilitre ont été transduites avec un vecteur viral exprimant la GFP ciblée vers le noyau, puis les cellules mortes ont été marquées avec de l'iodure de propidium ; transférez 100 microlitres de la suspension cellulaire dans un nouveau tube microcentrifuge.

Remarquez qu'une concentration de un fois dix puissance cinq à un fois dix puissance sept cellules par millilitre est recommandée pour le test, bien que la concentration n'ait pas besoin d'être exacte. Ensuite, ajoutez un microlitre de réactif Tally Dead Cell Red. Puis vortexez brièvement pour homogénéiser, incubez le mélange de réactif de marquage et de cellules à température ambiante à l'abri de la lumière pendant un à cinq minutes.

Après l'incubation, passez immédiatement à l'analyse sur le cytomètre imageant tally. Le tally utilise des lames en plastique jetables conçues spécifiquement pour l'appareil. Veillez toujours à tenir la lame par les bords pour la charger.

Introduisez lentement 25 microlitres d'échantillon à l’aide d’une pipette dans l’une des zones de chargement d’échantillon en forme de demi-lune. Ici, les cellules contrôles non transduites non marquées sont chargées dans la chambre A et les cellules marquées exprimant la GFP sont chargées dans la chambre B. Pour réaliser un test de viabilité sur des cellules exprimant la GFP, touchez G-F-P-R-F-P sur l’écran d’accueil du cytomètre. Les options du test apparaîtront alors à droite ; sélectionnez GFP plus viabilité.

L'appareil demandera ensuite s'il faut nommer la série d'échantillons pour nommer la série d'échantillons. Appuyez sur nommer maintenant. Ensuite, à l'aide de l'écran tactile, saisissez le nom de la série d'échantillons et appuyez sur enregistrer ; le cytomètre de comptage passera automatiquement à l'écran de mesure.

Ensuite, pour mesurer la fluorescence de fond, appuyez sur l'onglet « fond » situé dans la moitié inférieure droite de l'écran de mesure, comme indiqué ici. Le paramètre par défaut indique que neuf champs de cellules seront imagés. Maintenant, avec l'échantillon témoin orienté à l'opposé de l'appareil, insérez la lame dans le port de chargement jusqu'à ce qu'elle s'arrête.

Ne pas appliquer de pression sur l'écran tactile en arrière-plan pour insérer une nouvelle cellule témoin non colorée. La lame sera automatiquement introduite dans l'appareil et une image en direct des cellules s'affichera à l'écran. À l'aide de la molette de mise au point, amener les cellules dans le plan de vision approprié tout en effectuant la mise au point.

Faites glisser le bouton de zoom rouge vers 4 x ou 16 x. Pour mieux visualiser la population cellulaire, les cellules doivent être uniformément sombres avec un halo lumineux autour de chacune. Comme illustré ici, les cellules peuvent être sous-comptées lorsque la transition entre le fond et les bords des cellules est floue, de sorte que les limites cellulaires ne soient pas bien définies.

Les cellules peuvent être comptées en excès lorsqu'elles présentent un centre brillant et des périphéries sombres. Une fois les cellules mises au point, touchez ou appuyez pour exécuter le contrôle des cellules non colorées. Pour mesurer la fluorescence de fond, le cytomètre capturera automatiquement des images et affichera des miniatures de chaque champ observé.

La barre de progression fournit une mise à jour continue de l'analyse. Une fois la capture d'image terminée, le cytomètre éjecte automatiquement la lame et fournit les données issues de l'analyse des images capturées. Les données stockées s'affichent dans le menu déroulant de l'onglet arrière-plan.

L'échantillon témoin de fond sera attribué du même nom que celui donné à l'expérience. Pour exécuter l'échantillon transduit GFP coloré au PI, retirez la lame de l'appareil, retournez-la et réinsérez-la de sorte que l'échantillon transduit soit orienté à l'opposé de l'appareil. Appuyez sur l'onglet échantillon, puis touchez appuyez pour insérer le nouvel échantillon.

Lorsque l'image apparaît à l'écran, utilisez le bouton de mise au point pour focaliser les cellules. Comme précédemment, appuyez ensuite brièvement pour exécuter l'échantillon. Une fois la capture d'image terminée, les données de l'analyse s'affichent sous l'onglet échantillon et le cytomètre éjecte automatiquement la lame de manière appropriée.

Jetez la lame d'analyse cellulaire. Ces lames, considérées comme des déchets biologiques dangereux, ne peuvent pas être réutilisées. Une fois l'échantillon analysé, des seuils peuvent être appliqués à l'échantillon.

Pour analyser des populations cellulaires spécifiques ici, nous ajusterons les seuils afin de déterminer le pourcentage de cellules vivantes et mortes. Dans les cellules exprimant la GFP sous l'onglet échantillon, le nombre et le pourcentage de cellules exprimant la GFP, les cellules vivantes, les cellules mortes exprimant la GFP, la viabilité totale, la taille moyenne des cellules, le nombre de cellules comptées et la concentration cellulaire sont affichés.

En outre, des histogrammes affichant la taille des cellules, la fluorescence verte et la fluorescence rouge sont présentés en bas de l'écran. Pour définir le seuil de taille des cellules, touchez la vignette de taille cellulaire afin d'ouvrir l'histogramme de taille des cellules et d'exclure tous les débris. Déplacez les barres coulissantes bleues pour exclure les événements de grande et de petite taille.

Appuyez pour appliquer et inclure les cellules à l'intérieur des fenêtres. Pour ajouter la fluorescence GFP à l'analyse, appuyez sur la vignette de l'histogramme GFP. Pour l'ouvrir.

Déplacez la barre du curseur bleu pour régler le seuil juste à droite du pic le plus faible. Utilisez l'échantillon témoin comme guide. Cela permet à l'analyse d'inclure les cellules positives pour la GFP, tout en excluant les cellules autofluorescentes.

L'autofluorescence est fréquemment observée lorsque des molécules biologiques à l'intérieur des cellules sont mises en évidence. Appuyez sur écran tactile pour confirmer et revenir à l'écran précédent. Les données affichées sous l'onglet échantillon doivent maintenant refléter les seuils et les fenêtres définis pour les deux canaux de fluorescence. Ensuite, pour distinguer les cellules marquées au PI de l'autofluorescence ou de tout fond présent dans l'échantillon, appuyez sur la miniature de l'histogramme du PI afin de le rouvrir.

Le pic de l'échantillon témoin sera affiché sous forme d'un pic gris sur l'histogramme. Le pic rouge correspond à la fluorescence de l'échantillon. La fluorescence de fond est représentée par le pic le plus proche de la valeur zéro en unités de fluorescence relative (RFU) sur cet appareil.

Pour éliminer la fluorescence de fond dans le canal PI, déplacez la barre de défilement bleue afin d'ajuster le seuil. Pour exclure ce pic, utilisez le pic gris provenant de l'échantillon témoin comme référence. Une fois le seuil dans le canal PI correctement défini, appuyez sur appliquer pour confirmer et revenir à l'écran précédent ; l'instrument de comptage analysera de nouveau automatiquement les données et mettra à jour les résultats dans l'onglet échantillon.

Ensuite, pour confirmer visuellement que chaque cellule est correctement attribuée, appuyez sur l'onglet de zoom, puis sélectionnez un champ capturé à examiner en appuyant sur la miniature de l'image. Ensuite, appuyez sur l'onglet couches. Puis, appuyez sur le bouton GFP ou PI pour afficher l'image capturée à travers ce canal.

Appuyez à nouveau sur le même bouton pour supprimer la couche de l'affichage ou pour superposer les couches. Appuyez sur les boutons correspondant à chaque canal afin d'identifier la manière dont les cellules sont comptées via un canal particulier. Des cercles entourent les cellules qui ont été comptées uniquement à travers le canal de champ clair ; celles qui n'expriment pas de fluorescence seront entourées en bleu. Cela indique qu'une cellule particulière est une cellule vivante exprimant un signal dans le canal vert.

Les cellules exprimant GFP seront entourées en vert dans le canal rouge. Les cellules marquées au PI seront entourées en rouge et correspondent aux cellules mortes comptées dans les deux canaux. Les cellules apparaissant dans les canaux rouge et vert seront entourées en jaune.

Cela indique que la cellule exprime la GFP mais est également marquée au PI et est donc morte. Parfois, un cercle noir apparaît à l'écran. Il s'agit d'objets qui ont été identifiés mais exclus de l'analyse en fonction de la taille de la cellule.

Continuez à régler finement le seuil sur l'histogramme de fluorescence en suivant les étapes décrites ci-dessus jusqu'à ce que chaque cellule exprimant une fluorescence soit entourée de la couleur appropriée. Tous les paramètres d'analyse sont automatiquement enregistrés sur l'appareil sous l'onglet des données.

Le compteur peut stocker des fichiers de données provenant de 500 analyses d'échantillons. Chaque fichier enregistré dans l'onglet de données est disponible pour une nouvelle analyse. En sélectionnant le fichier dans l'onglet de données, celui-ci sera rouvert et tous les histogrammes et calques deviendront actifs afin d'archiver les données et de générer des rapports.

Les données stockées dans l'appareil peuvent être transférées vers un ordinateur à l'aide d'une clé USB. Quatre types cellulaires représentatifs ont été transduits avec une construction virale exprimant une protéine fluorescente verte (GFP) ciblée vers le noyau, puis colorés avec un kit de viabilité Tally utilisant le réactif Dead Cell Red, et analysés à l’aide du Tally sur un cytomètre en flux, comme illustré ici. Les deux méthodes ont indiqué approximativement le même pourcentage de la population exprimant la GFP pour chaque type cellulaire, ainsi que le pourcentage de la population totale à la fois viable et exprimant la GFP.

Ces données démontrent que le cytomètre Tali est capable de distinguer l'expression totale de la GFP dans une population de l'expression de la GFP dans la population vivante. Nous venons de montrer comment utiliser le cytomètre imageant Tali pour évaluer l'expression de la fluorescence et la viabilité dans votre échantillon cellulaire. Cette technologie comble le fossé entre les études cellulaires individuelles et celles portant sur des populations.

À l'aide du cytomètre imageant par comptage, vous pouvez recueillir des informations visuelles quantitatives et qualitatives sur des cellules individuelles ainsi que sur des populations cellulaires plus importantes. En utilisant la même procédure, plusieurs autres tests peuvent être réalisés, notamment l'apoptose, l'expression de RFP et la viabilité cellulaire. Pour les cellules non exprimantes, les applications potentielles incluent l'évaluation de l'expression génique jusqu'aux études sur l'efficacité des médicaments.