Techniques d'analyse permettant de doser la bioactivité d'oxyde nitrique

L'objectif général de l'expérience suivante est de démontrer comment détecter de manière précise et spécifique les métabolites de l'oxyde nitrique dans des échantillons biologiques. Cela est réalisé en traitant d'abord les échantillons sanguins immédiatement après leur prélèvement afin d'éviter la perte de métabolites ou la formation d'artéfacts. Parallèlement, une récolte rapide et efficace des tissus est effectuée pour minimiser les effets d'un environnement hypoxique sur les métabolites de l'oxyde nitrique.

Des anneaux aortiques sont prélevés et suspendus dans un bain d'organes afin d'évaluer leur fonction endothéliale. En outre, des dosages biochimiques sont utilisés pour quantifier les concentrations de nitrates, de nitrites ainsi que les niveaux relatifs de nitrothiols et d'autres produits nitrosés dans le tissu. Grâce à ces dosages, une comparaison appropriée entre animaux expérimentaux et témoins peut fournir des informations précieuses sur la production et le métabolisme de l'oxyde nitrique.

Le principal avantage de l'utilisation de cette approche multisystème par rapport à des méthodes ou dosages uniques réside dans la possibilité d'obtenir une vision plus complète de la biochimie du monoxyde d'azote dans plusieurs systèmes organiques. Nous pouvons ainsi commencer à comprendre quels métabolites pourraient présenter une utilité pronostique ou diagnostique, et comment le répertoire des métabolites du monoxyde d'azote reflète la formation et la disponibilité du monoxyde d'azote endothélial. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car chaque étape du processus est cruciale pour préserver l'intégrité de l'échantillon.

Certaines de ces étapes ne sont pas évidentes à la lecture de la section des méthodes dans un article scientifique typique, en raison du niveau de détail fin relatif au prélèvement des échantillons et à l'extraction des tissus. Ce protocole sera démontré par le Dr Hong Jing, chercheur principal dans mon laboratoire. Pour ce protocole, avoir à disposition une personne ou un animal de laboratoire pour un prélèvement sanguin, et dont les tissus seront également examinés.

Tout d'abord, prélevez du sang total en insérant une aiguille de calibre 25 dans la veine cave inférieure. Une fois que 500 à 1000 microlitres ont été collectés, perfusez l'animal pour éliminer le sang résiduel en infusant un tampon physiologique par l'apex du ventricule gauche, et laissez s'effectuer le remplacement complet du sang pendant que le sang et le tampon s'écoulent par la veine cave inférieure. Le sang veineux doit être recueilli immédiatement après le prélèvement dans des tubes de centrifugation de 1,5 millilitre contenant du NEM et de l'EDTA.

Faire centrifuger le sang à 14 300 RCF pendant sept minutes après la centrifugation. Aspirer le plasma à partir du culot de globules rouges à l’aide d’une pipette et le transférer dans un tube séparé. Préparer les échantillons de plasma isolé pour la HPLC en ajoutant d’abord un volume égal de méthanol froid à 50 microlitres de prélèvement de plasma.

Vortexez le mélange vigoureusement pendant trois à cinq secondes jusqu'à ce qu'il devienne trouble. Ensuite, centrifugez le mélange à 14 300 RCF pendant sept minutes. Pour précipiter les protéines plasmatiques, récupérez le surnageant dans un tube séparé de 1,5 millilitre et conservez-le à quatre degrés Celsius jusqu'à son analyse.

Pour préparer le plasma en vue d'une analyse par chimiluminescence, prenez le volume de plasma restant, qui doit être d'environ 200 à 400 microlitres, et divisez-le en deux volumes. Préparez une moitié du plasma en ajoutant un volume de 10 % de sulfure acide à 5 %, puis attendez 10 minutes. Cet échantillon est désormais prêt pour l'analyse par CLD.

Préparez l'autre moitié du plasma en ajoutant, après cinq minutes, 10 % en volume de chlorure mercureux à 2 %. À température ambiante, ajoutez 10 % en volume de sulfonamide acidifié. Attendez encore 10 minutes, puis injectez cet échantillon dans le détecteur à émission de lumière par chimiluminescence (CLD) comme pour le plasma.

Le culot de GR peut être préparé pour la CPG ou la DCL, selon l'analyse souhaitée. Commencez par mélanger une partie de culot cellulaire avec quatre parties de solution hypotonique de lyse. Vortexez soigneusement le mélange pour l'analyse par DCL.

La préparation des cellules est identique à celle effectuée pour le plasma. Commencez par ajouter un volume égal de méthanol. Ensuite, vortexez vigoureusement le mélange pendant trois à cinq secondes, puis centrifugez-le pendant sept minutes à 14 300 RCF.

Prélève maintenant le surnageant à l’aide d’une pipette et conserve-le à quatre degrés Celsius jusqu’à son analyse par HPLC afin de déterminer les concentrations tissulaires des métabolites de l’oxyde nitrique. Dans les tissus d’intérêt provenant des animaux expérimentaux, le sang doit d’abord être recueilli et préparé comme décrit dans la section précédente ; la récolte des tissus doit ensuite être effectuée comme d’habitude, en accordant une attention particulière à la rapidité et à l’efficacité afin d’éviter l’hypoxie tissulaire. Une fois prélevés, homogénéise les échantillons de tissu dans un rapport de un à cinq de PBS contenant du N-E-M-E-D-T-A.

Ensuite, préparez les tissus homogénéisés pour l'analyse par HPLC et CLD comme décrit dans les sections précédentes pour les GR. Après avoir anesthésié une souris adulte avec de l'éther de dathyle et confirmé qu'elle ne réagit pas à une pincée du orteil, pratiquez une thoracotomie. Une incision médiane est réalisée depuis le sternum jusqu'à la région pubienne afin d'exposer les cavités thoracique et abdominale.

Ensuite, perfuser l'animal avec un tampon Krebs Alite oxygéné. Utiliser une seringue de calibre 25 pour injecter le tampon dans l'apex du ventricule gauche. L'oreillette droite est ouverte afin de permettre l'évacuation du sang.

Après la perfusion, isoler l'aorte abdominale en découpant et enlevant le foie, les poumons et les autres tissus qui pourraient recouvrir l'aorte. Ensuite, tenir le cœur avec une paire de forceps et détacher délicatement l'aorte de la paroi postérieure de l'animal. Placer le cœur et l'aorte dans une boîte de Pétri remplie de glace.

Placer le tampon de Krebs froid dans la boîte. Retirer soigneusement la graisse et l'adventice de l'aorte. Éviter d'endommager l'endothélium à l'intérieur du vaisseau pendant le nettoyage.

Conservez le métabolisme des aortes lent pour prévenir l'hypoxie en les transférant toutes les cinq minutes dans un tampon frais, froid et oxygéné. Utilisez maintenant un scalpel pour découper l'aorte en segments annulaires de trois millimètres de long. Transférez les segments dans un bain d'organes tissulaires de 10 millilitres à quatre canaux, rempli de tampon de Krebs oxygéné.

À l'aide du bouton du transducteur, appliquez une précontrainte de 1,5 gramme à chaque anneau aortique. Selon des observations empiriques, 1,5 gramme est la tension initiale appropriée pour une fonction vasomotrice optimale.

Dans le moniteur de souris, enregistrez la mesure de force à l'aide d'un pont octal à huit canaux et d'un logiciel d'acquisition de données, laissez les anneaux s'équilibrer pendant 80 minutes, en changeant le tampon toutes les 20 minutes, puis procédez à l'expérimentation. Une fois la tension tissulaire équilibrée, ajoutez 100 nanomolaire de fennel rine à chaque anneau pour induire une contraction submaximale. Lorsque la tension des anneaux est stabilisée et qu'un niveau de tonus constant est atteint, effectuez une analyse de réponse dose-dépendante à un agoniste endothélial tel que l'acétylcholine.

Cela permettra de déterminer la production d'oxyde nitrique et le degré de relaxation des vaisseaux. Après la réponse dose-dépendante à l'acétylcholine, rincer les bains avec du tampon de Krebs et ajouter 100 nanomolaire de fennel rine dans chaque bain d'organe pour provoquer la contraction des vaisseaux. Ensuite, évaluer à nouveau la réactivité des anneaux de muscle lisse à une source exogène d'oxyde nitrique, telle que le nitroprussiate de sodium, en présence et en absence d'ODQ, un inhibiteur de la guanylate cyclase soluble.

Ce type d'approche permettra de déterminer une valeur de relaxation de 100 % pour les vaisseaux et démontre également le rôle essentiel de la guanylate cyclase soluble dans la médiation de la réponse de relaxation vasculaire à l'oxyde nitrique. Étant donné que l'ODQ empêchera la relaxation induite par le nitroprussiate de sodium en réponse à l'acétylcholine, les anneaux aortiques provenant de souris témoins sains se sont relâchés, tandis que les anneaux aortiques provenant de souris présentant une dysfonction endothéliale ont montré une relaxation réduite en raison d'une diminution de la production d'oxyde nitrique. Des dosages spécifiques de dénitrosylation ont également été réalisés sur les animaux témoins par chimiluminescence du nitrite.

Les RSNO et les RNNO ont été détectés à l'aide d'un essai de dénitrosation réductrice. En soustrayant les aires des pics, les niveaux de nitrite et de r sno ont été mesurés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du monoxyde d'azote et de la vascularisation, telles que : comment les concentrations circulantes de ces métabolites du monoxyde d'azote reflètent-elles les concentrations tissulaires, et comment les métabolites de la maladie varient-ils dans différentes conditions pathologiques ?

La détermination des concentrations à l'état d'équilibre et de la demi-vie de ces métabolites pertinents de l'oxyde nitrique dans plusieurs systèmes organiques et dans toute la circulation d'un même animal permettra d'identifier des signatures moléculaires spécifiques des processus pathologiques et nous aidera à définir de nouvelles modalités thérapeutiques fondées sur l'oxyde nitrique, offrant ainsi au clinicien de meilleurs biomarqueurs pour évaluer la gravité ou l'évolution d'une maladie. En général, les personnes novices dans le domaine de l'acide nitrique éprouveront des difficultés, car de nombreuses méthodes ne sont pas suffisamment sensibles pour détecter et quantifier les faibles concentrations de métabolites de l'acide tricarboxylique présentes dans les échantillons biologiques. Tout d'abord, une manipulation inadéquate lors de la préparation des échantillons risque de générer des artéfacts au cours du traitement, conduisant à des données erronées et à une interprétation incorrecte des résultats.