Imagerie quantitative de Lineage spécifiques Toll-like Receptor la signalisation médiée par les monocytes et les cellules dendritiques à partir de petits échantillons de sang humain

L'objectif général de l'expérience suivante est de démontrer l'utilisation de la technologie de cytométrie en flux d'images pour quantifier les mécanismes cellulaires des cellules immunitaires primaires provenant de cohortes de patients bien définies. Cela est réalisé en isolant d'abord les cellules mononucléées du sang périphérique ou pbmc à partir d'échantillons sanguins obtenus auprès de patients ou de volontaires sains. Après l'isolement, les cellules sont activées, puis marquées par fluorescence.

Ensuite, les cellules sont focalisées par voie hydrodynamique, excitées par un rayon laser et imagées selon une intégration à retard temporel sur une caméra CCD. Enfin, les images sont acquises à l’aide du cytomètre de flux d’images et une quantification de NF-kappa B est effectuée.

La translocation dans chaque image cellulaire est effectuée à l'aide du logiciel Ideas. En fin de compte, les différences entre chaque groupe de sujets peuvent être déterminées par l'analyse des nuages de points, des histogrammes et des images cellulaires. L'avantage du cytomètre imageur réside dans sa capacité à combiner les données de flux et l'immunofluorescence.

Nous sommes en mesure d'analyser les voies de signalisation cellulaire de manière spécifique à la lignée, qu'il s'agisse de cellules uniques ou de populations, en partant d'un échantillon sanguin de petite taille. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles en localisant et en quantifiant les intermédiaires de la signalisation. Par exemple, elle peut être utilisée pour étudier la translocation nucléaire médiée par des facteurs transparents ou pour examiner les effets du vieillissement sur la biologie cellulaire.

Un responsable de mon laboratoire démontrera la technique après avoir isolé des cellules mononucléées du sang périphérique obtenues auprès de volontaires humains. Resuspendre les PBMC récupérés à raison de trois fois 10⁶ cellules par 0,6 millilitre de milieu, puis transférer la suspension cellulaire dans des tubes de 1,5 millilitre. Ensuite, stimuler certaines des cellules avec un agent activateur tel que l'agoniste du TLR8, R848, illustré ici, puis incuber toutes les cellules à 37 °C pendant 10 à 60 minutes dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone.

Après la période d'incubation, centrifuger les cellules cinq minutes à 500 ×g à température ambiante, éliminer le surnageant, étiqueter les cellules avec un cocktail d'anticorps membranaires spécifiques des lignées monocytaire ou dendritique pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, y compris des tubes de cellules marquées avec des conjugués monochromes destinés à servir de contrôles de compensation. Ensuite, fixer les cellules dans du PFA-PBS à 4 % pendant 10 minutes à température ambiante. Après avoir centrifugé les cellules pendant 10 minutes à 500 ×g à température ambiante, resuspendre les PBMC dans du tampon de congélation et conserver les cellules à moins 80 degrés Celsius jusqu’au jour de l’analyse.

Décongeler rapidement les cellules dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius, puis après centrifugation pour éliminer le tampon de congélation, les permeabiliser avec 100 microlitres de tampon de perméabilisation BD. Ensuite, les marquer avec des anticorps dirigés contre des composants intracytoplasmiques de signalisation, tels que les anticorps anti NF kappa BP 65 illustrés ici, pendant 20 minutes à température ambiante. Après formation du culot, resuspendre les cellules dans 100 microlitres de tampon de perméabilisation BD contenant de l'anticorps caprin anti IgG de lapin.

Ajouter Alexa 647 et incuber les PBMC pendant encore 20 minutes à température ambiante. Juste avant l'acquisition, contre-tacher les cellules avec un colorant nucléaire. Commencer par allumer le système ImageStream, puis lancer le logiciel Inspire. Ensuite, cliquer sur Chargement du modèle par défaut, puis sélectionner Initialiser les fluidiques.

Ensuite, cliquez sur le menu de la galerie d'images et sélectionnez tout. Appuyez maintenant sur exécuter la configuration pour commencer l'acquisition d'images des billes, puis sélectionnez le canal de champ clair. Une fois que les billes de vitesse sont en cours d'exécution, cliquez sur démarrer tout sous l'onglet d'assistance pour étalonner et tester l'instrument.

Une fois le système ImageStream calibré, appuyez sur flush, verrouillez et chargez l'échantillon le plus brillant dans l'appareil. Réglez ensuite la puissance du laser de manière à ce que chaque fluorochrome présente une valeur maximale de pixel comprise entre 104 000 comptes, telle que mesurée sur les diagrammes en points. Définissez ensuite les critères de classification des cellules.

Cliquez maintenant sur Exécuter, puis sur Acquérir pour collecter et enregistrer le fichier de données de l'expérience. Pour analyser d'abord les fichiers de données, ouvrez le logiciel Analytical Software afin de créer des fichiers d'images compensés, puis appliquez un fenêtrage sur les événements présentant une intensité normale du colorant nucléaire et un rapport d'aspect élevé pour le colorant nucléaire. Pour distinguer les cellules uniques dans la fenêtre R1 des débris ou des événements multicellulaires, les monocytes se trouvent dans la fenêtre correspondant aux cellules positives pour CD14. Les cellules dendritiques myéloïdes, qui expriment fortement CD11c et faiblement CD4 ainsi que les marqueurs Lin1, sont situées dans la fenêtre R3.

Enfin, utilisez le logiciel Ideas pour déterminer la colocalisation du facteur de transcription cytoplasmique NF kappa B avec le colorant nucléaire. Une forte corrélation entre NF kappa B et le colorant nucléaire, indiquant une colocalisation des deux marqueurs, se traduit par un score de similarité élevé et reflète le degré d'activation de la cellule. Le pourcentage d'événements présentant une forte similarité entre différents groupes de traitement ou populations de patients peut être comparé afin d'évaluer l'efficacité fonctionnelle relative des cellules selon l'approche Ideas.

Des logiciels peuvent ensuite être utilisés pour afficher des images de cellules provenant de segments clés d'histogrammes de population. ImageStream permet le traçage de sous-populations cellulaires directement à partir de pbmc et l'imagerie des réponses cellulaires à partir de populations cellulaires traçées mais non triées. Ici, l'effet de la signalisation TLR sur la localisation nucléaire de NF kappa BP 65 dans les dcs myéloïdes lin one, négatifs pour CD quatre, CD 11 C positifs et faiblement exprimés a été quantifié au temps zéro.

Un pourcentage élevé de cellules non stimulées présentant le facteur de transcription NF kappa BP 65 dans le cytoplasme a été observé. Après stimulation, les cellules traitées ont montré un score de similarité significativement plus élevé entre NF Kappa BP 65 et la coloration nucléaire par le PI, indiquant que NF Kappa BP 65 s'est transloqué dans le noyau suite à la stimulation. Des images numériques acquises simultanément pour les populations cellulaires non traitées ou stimulées par R 8 48 illustrent des cellules représentatives ainsi que l'intensité de la translocation de NF kappa B dans le noyau cellulaire. Remarquez l'intensité plus marquée de la coloration de NF Kappa B et du PI dans le groupe stimulé par R 8 48 par rapport aux cellules non traitées.

Nous avons utilisé cette technique sur des cellules provenant de donneurs d'âges différents et avons mis en évidence des différences dans les voies d'activation de NF-kappa B médiées par les TLR. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une journée, avec un temps supplémentaire nécessaire pour l'analyse des images, permettant ainsi d'obtenir à la fois des images de localisation et des statistiques au niveau de la population. De plus, nous pouvons observer directement les réponses de plusieurs populations cellulaires sans séparation physique. Le cytomètre imageur peut être appliqué largement à de nombreux mécanismes cellulaires et devrait s'avérer très utile dans la recherche translationnelle.