Radioactif In situ D'hybridation pour détecter divers profils d'expression génique dans les tissus

L'objectif général de l'expérience suivante est d'identifier les régions d'expression génique particulière et de caractériser le moment et les niveaux d'expression génique afin de contribuer à la compréhension de la fonction des gènes. Cela est réalisé en récoltant et en préparant rapidement le tissu destiné à être utilisé dans la procédure, afin de préserver l'intégrité du tissu. Dans un deuxième temps, le tissu est traité pour réduire la liaison de fond des sondes ribonucléiques.

Ensuite, les sondes ribo sont hybridées au tissu et la liaison de la sonde RIBA est visualisée. L'utilisation d'un film radiographique ou d'une émulsion sensible à la lumière permet d'obtenir des résultats montrant l'emplacement et le niveau d'expression génique, basés sur des images radiographiques ou sur une analyse en microscopie en lumière transmise et en contraste de phase. À l'aide du logiciel Image J, plusieurs étapes critiques doivent être correctement réalisées, des erreurs fréquentes étant commises par de nombreuses personnes, notamment en ce qui concerne la prévention du bruit de fond.

Il existe donc plusieurs étapes pouvant entraîner un fond élevé, comme une saturation insuffisante ou un hybride réalisé à une température inappropriée. Une autre cause est la contamination par des ARN, qui dégradera votre sonde d'ARN. Vous devez donc faire attention à maintenir tout l'environnement exempt d'ARNases.

Et le troisième point est que, lorsque les lames sont plongées dans l'émulsion, vous devez vous assurer qu’il n’y a aucune fuite de lumière dans votre chambre noire ni d’exposition de l’émulsion à la lumière durant toutes les étapes du processus, qui peut durer trois semaines. Cette technique sera démontrée par Hun Chen, postdoctorant dans mon laboratoire. Après avoir prélevé un cerveau frais et l’avoir rincé dans du PBS 1x, inclure le cerveau dans un milieu OCT Tissue-Tek® en immergeant le cerveau dans un moule contenant ce milieu à température ambiante.

Veillez à orienter correctement le cerveau en fonction des besoins de la section. Ensuite, après avoir vaporisé du dioxyde de carbone solide (glace sèche) avec de l'éthanol, congélez le tissu en plaçant le bloc dans le mélange d'éthanol et de glace sèche. En prenant soin de ne pas introduire d'éthanol à l'intérieur du bloc, sectionnez le tissu congelé au cryostat en tranches de 10 à 12 micromètres d'épaisseur, puis déposez-les sur des lames Super Plus destinées aux tissus cérébraux et embryonnaires.

La température optimale de coupe se situe entre moins 18 degrés Celsius et moins 20 degrés Celsius. Conservez les sections dans une boîte à lamelles à moins 80 degrés Celsius. Transférez les lamelles depuis le stockage à moins 80 degrés Celsius vers une grille métallique placée sur de la glace sèche.

Ensuite, tout en travaillant dans une hotte certifiée, placer la grille dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % préalablement chauffée à trois à cinq degrés Celsius au-dessus de la température ambiante. Incuber pendant cinq minutes à température ambiante ; après l'incubation, retirer la grille du paraformaldéhyde et laver les lames en immergeant la grille dans du PBS 15 fois. Répéter cette étape de lavage deux fois en utilisant à chaque fois une solution fraîche de PBS.

Ensuite, immergez les lames dans un tampon d'acétylation fraîchement préparé pendant 10 minutes afin de réduire la liaison non spécifique de la sonde RIBA. Lavez ensuite les lames comme précédemment, mais cette fois en utilisant la solution de lavage SSPE deux fois. Déshydratez le tissu par une série d'éthanol à 70, 95 et 100 %, en deux minutes dans chaque solution.

Ensuite, faites sécher les lames sous la hotte pendant au moins 10 à 15 minutes. Après la synthèse de la sonde RIBA, conformément aux instructions du protocole écrit, calculez le volume requis de la sonde RIBA et de la solution d'hybridation nécessaire pour toutes les lames. Préchauffez le mélange d'hybridation de la sonde Ribo à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Pour dénaturer la sonde Ribo, pipeter 100 microlitres de la solution d'hybridation de la sonde Ribo et l'aligner sur la lame couvre-objet. Ensuite, utiliser une deuxième lame couvre-objet pour répartir uniformément la solution sur le tissu et la lame couvre-objet. Placer la lame horizontalement et orientée vers le haut dans un porte-lames en métal, puis, une fois que toutes les lames sont prêtes, immerger lentement le porte-lames dans un bain d'huile à 65 degrés Celsius pendant un minimum de quatre heures et un maximum de 16 heures.

L'huile crée un joint étanche autour des lamelles après l'incubation. Retirez tout excès d'huile du porte-objets métallique contenant les lamelles. Puis placez le porte-objets dans un bac en verre ou en métal contenant du chloroforme, sous une hotte aspirante. Répétez le lavage avec un deuxième bac contenant du chloroforme frais.

Ensuite, plongez le porte-lame dans une solution d'éthanol à 0,1 % de betta me cap plus deux fois la solution SSPE pour desserrer les lamelles et dissoudre l'excès de solution d'hybridation. Puis transférez les lames dans une seconde solution fraîche d'éthanol à 0,1 % de betta me cap plus deux fois la solution SSPE. Transférez les lames découvertes dans un porte-lame neuf placé dans un bac contenant de l'éthanol à 0,1 % de beta macca TER dans deux fois la solution SSPE, et incubez cette solution pendant une heure à température ambiante afin d'éliminer l'excès de sonde d'ARN non lié.

Ensuite, transférez le porte-objets vers une solution préchauffée composée de deux fois SSPE additionnée de 50 % de solution aqueuse à large spectre, à 65 degrés Celsius, contenant du captoéthanol bêta-ME à une concentration finale de 0,1 %, et incubez à 65 degrés Celsius pendant une heure. Après l'incubation, éliminez cette solution ainsi que toutes les solutions de lavage aqueuses précédentes et les lamelles comme déchets radioactifs. Par la suite, lavez les lames deux fois dans une solution préchauffée de 0,1 fois SSPE à 65 degrés Celsius, pendant 30 minutes chacune.

Ensuite, déshydrater le tissu par une série d'éthanol à 70 %, 95 % et 100 % pendant deux minutes dans chaque solution. Enfin, sécher les lames dans une hotte aspirante pendant au moins 30 minutes. Premièrement, déterminer si un signal radioactif est présent dans le tissu.

Placez les lames sèches dans une cassette à film, en travaillant dans une pièce sombre éclairée par une veilleuse, puis disposez un film radiographique sur les lames. Veillez à ce que les lames soient en contact avec la face émulsion du film, puis fermez la cassette. Exposez les lames au film de un à sept jours, selon l'abondance attendue des transcrits.

Une fois l'exposition terminée, révélez le film radiographique dans un révélateur et un fixateur standards. Le signal d'hybridation apparaîtra sous forme de zones noires sur le film, résultant des grains d'argent exposés dans l'émulsion, à côté de la résolution cellulaire, afin d'observer le signal directement sur le tissu. Les lames sont plongées dans une émulsion photographique, puis contre-colorées.

Si les lames doivent être contre-colorées avec du violet de crésyl, les sections doivent alors être liquéfiées selon les instructions du protocole écrit. À ce stade, en travaillant dans la chambre noire, versez de l'eau distillée dans un tube. Prélevez de l'émulsion NTB uc et diluez l'émulsion avec de l'eau distillée au ratio un pour un.

Après avoir fait fondre l’émulsion dans un bain-marie à 42 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes, transférez-la dans un récipient en verre de trempage placé dans un bain-marie à 42 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes. Le niveau de l’émulsion diluée doit maintenant recouvrir toutes les sections d’une lame lorsque celle-ci est immergée. S’il y a un grand nombre de lames, une quantité supplémentaire d’émulsion peut être nécessaire.

Plongez maintenant les lames dans l'émulsion diluée dans un bain-marie à 42 degrés Celsius, puis faites sécher les lames par trempage dans un récipient clos étanche à la lumière, toute la nuit dans une chambre noire, ou dans une étuve à 37 degrés Celsius pendant deux à trois heures avec les lumières éteintes. Après le séchage, transférez les lames dans une boîte à lames. Scellez les bords avec du ruban isolant noir, puis recouvrez-les de papier d'aluminium.

Conserver les boîtes à quatre degrés Celsius pendant plusieurs jours à plusieurs semaines avant la révélation ; avant utilisation, porter les lames à température ambiante. Ensuite, en travaillant dans la chambre noire, retirer le porte-lames contenant les lames des boîtes et les révéler dans le révélateur codec D 19 à 16 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes. Puis rincer les lames révélées à l’eau du robinet à température ambiante pendant une minute.

Ensuite, incuber les lames deux fois dans la solution de fixation à 19 degrés Celsius pendant six minutes chacune ; les lumières de la pièce peuvent être allumées pendant la seconde incubation dans le fixateur. Laver maintenant les lames à l'eau courante à température ambiante pendant au moins 30 minutes. Puis, à l'aide d'une lame de rasoir, gratter l'émulsion à l'arrière de la lame tant qu'elle est encore humide.

Enfin, contre-colorer avec du violet de crésyl à 0,3 %, puis déshydrater et monter les lames selon les instructions du protocole écrit, si nécessaire. Retirer davantage l'excès d'émulsion présent à l'arrière des lames en humidifiant avec de l'eau et en grattant avec une lame de rasoir. Rincer les lames dans une solution d'éthanol à 80 % et essuyer doucement une à deux fois pour éliminer les débris et la poussière.

Prendre des images en éclairage en champ sombre ou en champ clair. Les étapes de raclage et de nettoyage peuvent devoir être répétées deux à trois fois afin d'obtenir de bonnes images sans particules de poussière, facilement visibles en champ sombre au microscope stéréo. Les images suivantes sont des exemples d'autoradiographies d'hybridations in situ provenant de films radiographiques.

Cette image radiographique montre une coupe sagittale complète de la tête du passereau zébré à dix jours de développement embryonnaire, hybridée avec une sonde riboprobe antisens pour Fox P1. Les grains noirs révélés sur la pellicule indiquent l'expression de l'ARN messager, visible dans les quatre régions cérébrales. L'ARN messager de Fox P1 est enrichi dans le mésocéphale, le striatum et le thalamus dorsal. L'image radiographique montre une section provenant du même passereau zébré hybridée avec la sonde RIBA de 90 cents pour Cuper.

TF deux Co.TF deux est enrichi dans la région du palam alium et du thalamus plus ventral. Les images suivantes sont des exemples d'autoradiographies d'hybridations in situ provenant de lames plongées dans une émulsion. Cette image en champ sombre, prise au microscope stéréoscopique, montre une section sagittale complète de la tête d'un moineau domestique au sixième jour après l'éclosion, hybridée avec une sonde ARN antisens pour Fox P un.

Les grains d'argent blancs exposés dans l'émulsion au-dessus du tissu montrent l'expression de l'ARN messager. La couleur rouge représente la coloration au violet de kressel. La barre d'échelle représente un millimètre.

Ici, l'image montre une coupe du même passereau, le diamant de Java, hybridé avec une sonde ribo antisens pour le facteur de transcription coop TF deux. Les images suivantes comparent l'étiquetage antisens et sens, révélant des motifs différents visibles sur l'autoradiographie de sections sagittales de cerveau de diamant de Java prélevées au douzième jour embryonnaire. La ligne en pointillés indique le contour du cerveau entier et la lettre C marque le cervelet.

On observe que le brin antisens de PAC six est exprimé dans le cerveau, particulièrement dans la zone ventriculaire. La coupe adjacente hybridée avec le brin sens de pack six ne révèle aucune expression de fond dans la tête de l'embryon, mais une expression apparente dans la couche pigmentaire de la rétine, tout comme le brin antisens. Les images suivantes montrent, en C, deux signaux d'expression génique et des lames recouvertes d'émulsion provenant du cerveau de moineau zébré lors des stades embryonnaires tardifs, observées en lumière blanche et en champ sombre.

Cette image en champ clair montre l'expression de D one B au dixième jour embryonnaire. À partir d'une exposition normale à l'émulsion, le marquage qui apparaît noir est à peine visible à cet agrandissement. Cette image montre une section identique et le même agrandissement que dans l'image précédente, mais en vue en champ sombre, mettant en évidence le marquage en blanc dans le striatum et le thalamus.

Cette image en champ clair montre l'expression de slit trois au douzième jour embryonnaire. Après une surexposition à l'émulsion, le marquage noir est facilement visible. SC indique la position de la moelle épinière et CB indique la position du cervelet.

Le rostral est orienté vers la gauche. L'image présentée ici correspond à la même section, et l'agrandissement est identique, mais en vision champ sombre, montrant une étiquette en blanc dans la moelle épinière qui correspond à l'image en champ clair. Les images suivantes montrent la résolution des grains d'argent au niveau cellulaire.

On observe ici l’hybridation de l’ARN messager de Fox P1 dans le prosencéphale du moineau zébré ; les grains d’argent apparaissent comme des taches noires au-dessus des cellules colorées au violet de crésyl. Cette image montre une expression abondante au niveau de cellules individuelles dans le mésencéphale du moineau zébré adulte. Cette image montre une expression faible au niveau de cellules individuelles dans l’alium adjacent de la même coupe ici.

Bonjour Fox. L'expression de l'ARN messager P1 est observée dans le mésentère au jour embryonnaire 12.

Les cellules embryonnaires visibles ici sont plus petites et plus étroitement compactées par rapport aux cellules adultes observées sur les deux images précédentes. Enfin, cette image montre une expression de faible abondance au niveau des cellules de l'alium adjacent de la même section. Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes comme l'immunochimie peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que le type cellulaire sur lequel le gène cible est exprimé.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière effectuer l'hybridation in situ. N'oubliez pas que travailler avec des réactifs radioactifs peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que les protections individuelles doivent toujours être prises durant cette procédure.