Spatio-temporelle de manipulation de l'activité GTPase Petit au niveau subcellulaire et sur des échelles de secondes dans les cellules vivantes

Ce vidéo montre une méthode dans laquelle la lumière UV est utilisée pour contrôler l'activité d'une protéine au niveau de la membrane plasmique. Pour ce faire, les cellules sont cotransfectées avec une protéine FRB ancrée à la membrane et la protéine d'intérêt fusionnée à FK BP. Un dérivé de la rapamycine photo-capturée est ajouté au milieu.

Ensuite, lors de l’imagerie de cellules vivantes, une lumière UV est appliquée à une région spécifique de la cellule. Le lien entre la rapamycine et la biotine est clivé, libérant le dimérisateur chimique ainsi que son sous-produit ; le dimérisateur libéré diffuse dans les cellules et induit la dimérisation entre la protéine cible marquée par FKBP et la FRB ancrée à la membrane plasmique dans la région irradiée. En l’absence de rayonnement UV, FKBP et FRB ne s’associent pas, n’entraînant ainsi aucun effet.

L'analyse des données révèle un recrutement hautement localisé de la protéine d'intérêt fusionnée à FKBP, basé sur son effet physiologique. L'avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les approches pharmacologiques et génétiques réside dans la combinaison de la rapidité d'action, de la spécificité ciblée et de la résolution spatiale. Les implications de cette technique s'étendent vers le traitement des métastases cancéreuses, qui résultent de la migration des cellules cancéreuses.

Par conséquent, la manipulation de l'activité de facteurs clés de migration pourrait révéler leur mécanisme moléculaire précis, une condition préalable à leur traitement et guérison. La procédure sera démontrée par Chris Paul Meyer, étudiant diplômé, et Bob de Rose, technicien de mon laboratoire. Commencez ce protocole en mélangeant les éléments suivants dans un tube stérile de microcentrifugeuse : plasmide, ADN, FRB ancré à la membrane marqué de façon fluorescente, FKBP, TIA un et de l'eau déionisée. Ajoutez un microlitre d'ADN polymérase HD au mélange et vortexez.

Incuber le tube à température ambiante pendant 20 minutes. Pendant l'incubation, ajouter 50 microlitres de poly-d-lysine dans chaque puits d'une chambre en verre à huit puits et incuber pendant une minute afin d'enduire la surface, puis aspirer la solution et laver le centre de chaque puits avec 50 microlitres d'eau déionisée. Ensuite, la trypsine est ajoutée à des cellules NIH 3T3 ayant atteint une confluence de 80 à 85 %.

Une fois les cellules détachées, ajouter 10 millilitres de DMEM contenant 10 % de FBS, transférer 375 microlitres de la suspension dans un tube stérile de 15 millilitres et centrifuger à 1 500 ×g pendant trois minutes. Après la centrifugation, aspirer soigneusement le milieu. Ajouter 750 microlitres de DMEM avec 10 % de FVS et Resus.

Resuspendre le culot en pipettant doucement plusieurs fois de haut en bas. Enfin, ajouter la suspension cellulaire à la solution de transfection et, à l’aide de la pointe de pipette, mélanger délicatement, puis ajouter 250 microlitres de la suspension cellulaire de transfection dans chaque puits de la chambre. Faire glisser et incuber.

37 degrés Celsius pendant 15 à 18 heures. Pour synthétiser le rapamycine en cage, adduit de biotine. Commencez par préparer une solution mère de CRB à un millimolaire dans du DMSO dans un tube stérile pour centrifugeuse, puis dans un autre tube micro-centrifuge de 1,5 millilitre, dissolvez un milligramme d'avadon dans 250 microlitres de PBS.

Ensuite, conjuguer le groupe protecteur au rapamycine. Ajouter 0,5 microlitre de la solution mère de CRB au AVID dissous en mélangeant par retournements successifs, puis incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Pour obtenir la solution conjuguée de CRB-AVID, éliminer les petites molécules non liées et purifier le CRBA, équilibrer une colonne de filtration par exclusion de taille G-25 avec 300 microlitres de PBS.

Répétez cinq fois après l'équilibrage de la colonne. Appliquez 125 microlitres de solution CRBA sur le centre de la colonne. Ensuite, centrifugez la solution pendant deux minutes à 800 G à température ambiante, puis récupérez l'écoulement dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre après la transfection des cellules.

Remplacer le milieu par du DMEM sans FBS afin de priver les cellules de sérum et incuber pendant 12 heures. Après l'incubation, aspirer délicatement le milieu et ajouter 250 microlitres de la solution de CRBA préparée à une concentration d'un micromolaire. Ensuite, pour visualiser la dynamique des protéines dans des cellules vivantes, utiliser un microscope confocal à disque tournant avec éclairage UV afin de coupler les optiques à une diode électroluminescente UV de 365 nanomètres.

Avec lumière d'épifluorescence. Définir les coordonnées et la taille d'un point d'illumination en utilisant une lame de verre revêtue de colorants fluorescents excités par la lumière UV. Cela permet un réglage précis de la zone à irradier.

Placer la lamelle-chambre contenant les cellules sur la platine en utilisant un objectif 100 x et la fluorescence en épiscopie. Mettre les cellules au point et localiser une cellule. Pour l'acquisition d'images, commencer à imager les cellules après avoir déterminé les niveaux de fond de l'effet physiologique.

Ici, les ondulations de la membrane sont mesurées en irradiant une lumière UV dans un quadrant choisi de la cellule, ce qui libère la rapamycine initialement piégée, puis en la dissolvant d'abord dans du DMSO et ensuite dans du PBS à une concentration finale de 400 nanomolaires. Ajouter 100 microlitres de cette solution dans la chambre d'observation afin d'induire des effets globaux. Acquérir des images de fluorescence toutes les 15 secondes pendant 20 minutes afin de déterminer si une activation localisée de la RAC peut induire la formation de plis membranaires locaux.

Des cellules NIH trois T trois ont été transfectées avec l'activateur de RAC marqué par YFP, FK bp, TIA un et LDR, qui est ancré à la membrane. Une irradiation localisée FRB au bord de la cellule, indiquée par le cercle jaune, a été suivie d'une illumination globale avec une lampe au mercure pendant une seconde à partir de 1063 secondes. Comme on peut le voir ici, presque aucun bourrelet membranaire n'était présent au départ.

Cependant, après une illumination localisée, des ondulations spatialement confinées ont été observées suite à une illumination globale et à l'ajout de rapamycine, ce qui provoque la translocation de FK bp TIA un vers la membrane plasmique. La cellule a montré une formation d'ondulations globales, indiquant que la formation d'ondulations locales observée précédemment était due à une activation spatialement confinée de rack. Pour une analyse quantitative, les cellules cibles ont été divisées en quatre quadrants et la fréquence de formation des ondulations dans chaque quadrant, après stimulation locale ainsi qu'après stimulation globale, a été déterminée, comme illustré sur ce graphique.

Aucune des cellules observées n'a montré de formation de ruffles avec le CRBA sans irradiation UV ou sans UV local, une irradiation avec ou sans Aden en milieu massif. Toutefois, lorsque le CRBA a été ajouté et qu'une irradiation UV a été effectuée, la formation de ruffles a été observée à environ le même niveau, soit environ 90 % dans tous les quadrants avec une irradiation globale ; lorsque seul le quadrant un a été irradié, la fréquence de formation de ruffles était de 100 % par rapport à 30 %, 25 % et 30 % dans les quadrants deux à quatre. Ces résultats indiquent que le décage localisé de la rapamycine peut être utilisé pour induire des effets physiologiques hautement localisés dans une cellule unique.

Dans ce cas, le bourrelet de la membrane est provoqué par l'activation de rack. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'obtenir un contrôle spatiotemporel de l'activité des protéines G TPAs par la lumière. Cette méthode pourrait être appliquée à tout processus physiologique dépendant de la translocation de protéines spécifiques vers la membrane plasmique.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de préparer systématiquement des solutions, des réactifs et des cellules fraîches pour chaque expérience. N'oubliez pas que le travail avec la lumière UV peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de lunettes de protection contre les UV doivent toujours être prises.