Caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules endothéliales formant colonie dérivés du sang de cordon ombilical humain

L'objectif général de cette procédure est d'expliquer comment obtenir des cellules formant des colonies endothéliales, ou eCFCs, à partir de sang de cordon ombilical humain. Cette obtention s'effectue en premier lieu en ensemencant des cellules mononucléées provenant du sang de cordon ombilical, puis en clonant et en amplifiant les colonies issues des eCFCs. La deuxième étape consiste à caractériser les cellules in vitro à l'aide d'une nouvelle technique d'essai monocellulaire permettant d'évaluer leur potentiel prolifératif clonal.

Enfin, les cellules sont caractérisées au moyen d'un test de formation de vaisseaux in vivo, par la production et l'implantation de gels contenant des CFC-E chez des souris nod skid. En définitive, la formation in vivo de nouveaux vaisseaux remplis de sang de l'hôte peut être évaluée par une coloration à l'hématoxyline et à l'éosine des implants cellulaires contenant des CFC-E. Le principal avantage de ces techniques par rapport aux méthodes existantes réside dans leur capacité à examiner le potentiel prolifératif des cellules endothéliales au niveau de la cellule unique.

Les implications de cette technique pourraient être étendues à la recherche d'outils diagnostiques et thérapeutiques pour des maladies telles que la maladie artérielle périphérique ou PAD, car cette technique nous permet d'examiner le potentiel prolifératif et la capacité génique des cellules endothéliales d'un patient. Avant de commencer la procédure, ajoutez un millilitre de collagène de queue de rat, de type I, dans chaque puits d'une plaque de culture tissulaire à six puits, puis incubez la plaque toute la nuit le jour de la procédure. Aliquotez le sang de cordon en unités de 15 millilitres dans des tubes coniques de centrifugeuse de 50 millilitres. Ajoutez ensuite 20 millilitres de PBS à chaque tube et pipetez le mélange plusieurs fois vers le haut et vers le bas.

Ensuite, prélevez 15 millilitres de Ficoll-Paque™ dans une pipette, placez l'embout de la pipette au fond du tube contenant le sang dilué et superposez délicatement le Ficoll-Paque™ en dessous du sang. Centrifugez les tubes pendant 30 minutes à 740 × g à température ambiante, sans utiliser le frein de décélération. Après la séparation des cellules, utilisez une pipette de transfert pour retirer la couche trouble de cellules mononucléées à faible densité située à l'interface entre le Ficoll-Paque™ et le plasma dilué. Transférez les cellules recueillies dans un tube conique de 50 millilitres contenant 10 millilitres de milieu EGM-2™ et centrifugez les cellules mononucléées pendant 10 minutes à 515 × g à température ambiante, en utilisant le réglage de frein de décélération élevé. Aspirez soigneusement et jetez le surnageant.

Ensuite, après avoir lavé deux fois les cellules en culot avec l'EGM, resuspendez les cellules mononucléées dans l'EGM à raison de 1,25 × 10⁷ cellules par millilitre. Ajoutez maintenant à l’aide d’une pipette 4 millilitres de la suspension de cellules mononucléées dans chaque puits de la plaque revêtue de collagène et incubez les cellules jusqu’à la formation de colonies le premier jour. Après l’incubation, retirez lentement le milieu usé des puits à l’aide d’une pipette, sans perturber les cellules faiblement adhérentes.

Ensuite, ajoutez soigneusement quatre millilitres de E GM deux dans les puits et remettez la plaque dans l'incubateur. Des colonies apparaissent généralement entre le cinquième et le quatorzième jour, la veille de la procédure. À 50 microlitres de collagène de queue de rat.

Placer un type dans chaque puits d'une plaque 96 puits comme précédemment et incuber la plaque toute la nuit le jour de la procédure. Commencer par laver deux fois les cellules ayant été passagées seulement deux à trois fois avec du PBS. Après avoir aspiré le dernier lavage de PBS, placer un cylindre de clonage stérile recouvert de gel autour de chaque colonie, en appuyant fermement chaque cylindre contre la plaque à l’aide de pinces stériles.

Ajoutez deux à trois gouttes de milieu triple E chaud dans chaque cylindre de clonage et incubez les cylindres pendant trois à cinq minutes, jusqu'à ce que les cellules commencent à se détacher. Une fois que les cellules ont commencé à se détacher, ajoutez environ 250 microlitres de milieu EGM deux au centre du cylindre et pipetez plusieurs fois vers le haut et vers le bas afin d'obtenir une suspension monocellulaire. Transférez ensuite séparément la suspension monocellulaire provenant de chaque cylindre de clonage dans un tube microcentrifuge individuel.

Infectez les cellules dans une plaque de six puits avec des lentivirus exprimant EGFP et récupérez les cellules exprimant EGFP par cytométrie de flux fluorescente. Incubez ensuite les cellules positives pour EGFP et EGM deux dans des plaques revêtues de collagène. Lorsque les CFC-EC sont prêts, collectez-les en utilisant Trip E Express comme vient d'être démontré et resuspendez les cellules dans le milieu EGM deux à une concentration finale d'environ 10⁶ cellules par millilitre.

Ensuite, à l’aide d’un trieur à flux avec un débit faible de 20 cellules par seconde, trier une seule cellule ECFC positive pour EGP par puits dans la plaque de 96 puits préalablement préparée et revêtue de collagène, puis ajuster le volume final de chaque puits à environ 200 microlitres par puits avec le milieu EGM deux. Ensuite, utiliser un microscope à fluorescence inversé pour s’assurer que chaque puits contient une seule cellule. Incuber la plaque pendant une période de deux semaines avec deux changements de milieu au jour 14 de la culture.

Lavez chaque puits avec 100 microlitres de PBS avant de fixer les cellules avec 100 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 minutes. Pour les CFC qui n'expriment pas l'EGFP, ajoutez le réactif cyt, un colorant nucléaire fluorescent vert, après la fixation au paraformaldéhyde et incubez à quatre degrés Celsius toute la nuit. Utilisez un microscope à fluorescence pour quantifier visuellement le nombre de cellules endothéliales étendues comme indiqué ici : les puits présentant un nombre de cellules endothéliales compris entre deux et 50 sont considérés comme des agrégats de cellules endothéliales.

Les puits contenant de 51 à 2000 cellules correspondent à des CFC à potentiel prolifératif faible et ceux contenant 2001 cellules ou plus sont considérés comme des CFC à potentiel prolifératif élevé. Après avoir détaché les cellules avec la triple E comme précédemment indiqué, déterminer le nombre de cellules viables de la culture cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et du bleu de trypan. Transférer 2,4 millions de cellules viables dans un tube conique de 50 millilitres, puis former un culot cellulaire par centrifugation pendant que les cellules sédimentent.

Mélangez soigneusement les composants de la matrice de gel, puis ajustez le pH à 7,4 à l’aide d’hydroxyde de sodium tout en maintenant la solution sur de la glace. Après avoir éliminé le surnageant, resuspendez le culot dans 360 microlitres de e GM deux tiède. Ajoutez ensuite 840 microlitres de la solution de matrice de gel aux cellules et mélangez délicatement la solution jusqu’à ce que les cellules soient complètement suspendues dans le gel. Transférez cette suspension de gel cellulé de un millilitre dans un puits d’une plaque de culture de tissus à 12 puits et incubez la plaque jusqu’à ce que le gel polymérise.

Ensuite, avant une incubation nocturne, recouvrez délicatement le gel avec deux millilitres de milieu EGM-2 tiède le lendemain, et ce immédiatement avant l'implantation. Utilisez des ciseaux à iris pour disséquer le gel en deux morceaux égaux et remettez les fragments de gel dans le même puits de culture contenant le milieu EGM-2. Après avoir confirmé la sédation par une pincée du orteil, rasez l'abdomen inférieur d'une souris nod, skid anesthésiée âgée de cinq à six semaines, puis nettoyez soigneusement le site chirurgical à l’aide de compresses imbibées d’alcool et de bétadine, en effectuant des rotations.

Ensuite, utilisez des ciseaux iris stériles et tranchants pour pratiquer une incision d'environ cinq millimètres dans le quadrant inférieur de l'abdomen, exposant l'espace sous-cutané situé entre la peau et le muscle abdominal. Disséquez par technique contondante la couche dermique du muscle abdominal en deux régions différentes de l'abdomen afin de créer des poches larges de 15 à 20 millimètres, l'une s'étendant supérieurement vers le quadrant abdominal supérieur et l'autre vers une autre zone de l'abdomen. Puis soulevez la couche dermique juste à côté de l'incision.

Insérez une moitié du gel dans une poche abdominale, et l'autre moitié du gel dans l'autre poche abdominale. Une fois les gels insérés, fermez chaque incision par deux à trois points de suture à l’aide de sutures en polypropylène 5-0 montées sur une aiguille coupante. Étiquetez les cartes des cages et effectuez la surveillance postopératoire ainsi que l’administration d’antalgiques conformément aux exigences institutionnelles et au protocole.

Après avoir sacrifié l'animal au jour 14 après l'implantation, passez un tampon imbibé d'alcool sur l'abdomen de la souris et incisez la peau suivant la ligne de l'incision initiale. Ensuite, excisez des lambeaux de peau situés à l'emplacement probable des gels. Effectuez des incisions circulaires autour des gels pour retirer chaque implant, puis placez les implants excisés dans le fixateur au zinc.

En utilisant cette technique de dérivation des CEFC, nous avons observé une prolifération formant des colonies primaires dès le cinquième jour. Remarquez la morphologie en pavé caractéristique de ces cultures de CEFC au jour cinq, indiquée par les flèches. Les colonies étendues expriment des antigènes endothéliaux, mais n'expriment pas d'antigènes hématopoïétiques.

Comme le montre cette évaluation phénotypique in vitro représentative des cellules endothéliales et hématopoïétiques, l'immunophénotypage a révélé que les CFC-E expriment des antigènes endothéliaux tels que CD31, CD34, CD144, CD146, FL1, Flk1, Flt4 et NRP2, mais n'expriment pas d'antigènes hématopoïétiques, tels que CD45, CD14, CD11b, c-Kit, CXCR4 ou CD133. Importamment, comme illustré dans ce graphique en barres, les colonies expansées présentent une hiérarchie complète de potentiel prolifératif clonal au niveau de la cellule unique, allant de groupes de deux à 50 cellules jusqu’à des colonies de plus de 2001 cellules. Ces microphotographies de colonies marquées avec le Cyt, un colorant nucléaire fluorescent vert, ont été obtenues après culture de CFC-E issues de sang de cordon à l’échelle de la cellule unique pendant 14 jours.

De plus, les CFC forment des vaisseaux sanguins humanisés perfusés avec des globules rouges de l'hôte lorsqu'ils sont implantés chez des souris immunodéficientes. Dans cette coloration hématoxyline-éosine d'implants de gel CELLULARIZE contenant des CFC issues du sang de cordon, on peut observer des microvaisseaux remplis de globules rouges de l'hôte, formés dans le gel de collagène-fibronectine après 14 jours d'implantation. Ici, la coloration brune anti-CD31 humain confirme davantage l'origine humaine de ces vaisseaux.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler les CFC-E à partir de sang de cordon ombilical humain, ainsi que comment cloner, amplifier et caractériser la fonctionnalité des colonies de CFC-E après leur développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en endothélium vasculaire pour explorer le potentiel prolifératif clonal et la capacité génique des cellules endothéliales provenant de multiples sources.