L'avidité d'un dépistage interaction extracellulaire (AVEXIS) pour la détection évolutive de faible affinité extracellulaires interactions récepteur-ligand

L'objectif général de cette procédure est de découvrir de nouvelles interactions protéiques extracellulaires impliquées dans les processus de reconnaissance cellulaire, en particulier les protéines réceptrices intégrées dans la membrane. L'approche AveXis est conçue pour contourner l'affinité très faible caractéristique de cette classe d'interactions protéiques ainsi que la difficulté de manipuler biochimiquement les protéines membranaires. Ceci est réalisé en premier lieu en constituant une bibliothèque de protéines recombinantes des régions extracellulaires des récepteurs de surface cellulaire.

Cela est réalisé en concevant des plasmides d'expression pour produire les régions des domaines ectos de récepteurs sous forme de fragments solubles, à la fois comme appâts monomériques biotinylés et comme appâts pentamériques marqués par une enzyme. La deuxième étape consiste à exprimer et normaliser les protéines afin de les préparer pour un criblage d'interactions. Toutes les protéines sont produites dans des cellules de mammifères afin de garantir l'ajout de modifications post-traductionnelles telles que les ponts disulfure et la glycosylation.

Une étape cruciale du protocole consiste à s'assurer que les protéines appât et proie au sein de la bibliothèque sont toutes normalisées à des niveaux seuils. Suit ensuite la partie passionnante, le criblage de nouvelles interactions. Les Bates sont répartis dans des puits individuels d'une plaque microt et ensuite analysés pour détecter les interactions à l'aide du praise.

Ensuite, une étape de lavage est effectuée. La dernière étape consiste à ajouter le substrat de l'enzyme afin de détecter toute capture d'interaction sur les réseaux de protéines appâts. En fin de compte, les résultats d'un criblage VEX peuvent montrer quels récepteurs de surface cellulaire sont capables de former des partenaires de liaison et pourraient ainsi être impliqués dans les processus de reconnaissance et de communication entre cellules.

Le principal avantage de cette technique par rapport à des méthodes populaires d'extraction de protéines, telles que le système deux-hybride chez la levure ou les purifications biochimiques, est qu'elle est spécifiquement conçue pour détecter les interactions entre protéines extracellulaires. Elle est particulièrement adaptée à la découverte de nouvelles interactions entre protéines réceptrices ancrées à la membrane. Ces interactions sont difficiles à détecter à l'aide d'autres techniques, car les protéines membranaires sont biochimiquement difficiles à manipuler et leurs interactions avec les récepteurs correspondants sont généralement extrêmement faibles.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles concernant la manière dont les cellules se reconnaissent et communiquent entre elles. Au niveau moléculaire, elle peut être utilisée pour répondre à des questions relatives à des processus biologiques fondamentaux, comme lesquelles des protéines réceptrices exposées à la surface des ovules et des spermatozoïdes s'associent entre elles, ou quelles interactions récepteur-ligand sont responsables de comportements cellulaires tels que la fusion des myocytes ou la formation de la crête neurale. La principale difficulté de cette approche consiste à constituer les bibliothèques de protéines appâts et proies au sein desquelles rechercher les interactions.

Il est également très important de s'assurer que les protéines appât et proie sont normalisées à des niveaux seuils requis pour le test. Cela réduit la fréquence des faux négatifs et des faux positifs. J'ai eu l'idée de cette méthode pour la première fois durant mon doctorat, lorsque j'essayais d'identifier un partenaire de liaison pour la protéine membranaire CD 200.

Essentiellement, je posais la question suivante : quel est le profil de liaison pour ce récepteur particulier situé à la surface de la cellule ? Même aujourd'hui encore, cette question reste techniquement difficile à résoudre. À l'époque, toutefois, le génome humain était presque entièrement séquencé, et j'ai compris que, puisque nous disposions désormais d'une liste complète de tous les récepteurs de surface cellulaire présents dans le génome, nous pouvions désormais nous demander, au sein de cet ensemble de protéines réceptrices, lesquels pouvaient interagir sur le plan technique.

Il s'agit d'une question bien plus facile à répondre, et AveXis était la méthode que nous avons développée pour y répondre. Une fois qu'une bibliothèque de vecteurs d'expression d'appât et de prédicat a été établie, préparez-vous à les transfecter dans des cellules HEC 2 9 3 E en commençant par ensemencer les cellules la veille de la transfection à une densité de 250 000 cellules par millilitre dans 50 millilitres de milieu freestyle 2 9 3 afin d'assurer une élution efficace de la biotine. Complétez le milieu utilisé pour produire les protéines appât, et non les protéines proies, avec de la D-biotine. Une fois toutes les plaques préparées, incubez les cellules toute la nuit dans des conditions standard.

Étant donné que la biotine a une faible solubilité et une dissolution précise, nous préférons peser la biotine supplémentaire, puis l'ajouter au milieu et agiter vigoureusement le lendemain. Transfectez 50 millilitres de cellules en culture avec 25 microgrammes du plasmide appât ou proie en utilisant un réactif de transfection approprié afin de produire des appâts biotinylés ; effectuez une co-transfection du construit appât à un ratio de 10 pour 1 avec des plasmides codant une forme sécrétée de la protéine ELI, la ligase de biotine, par rapport à la récolte.

Les cultures, cinq jours après la transfection, sont d'abord mises en pellet par centrifugation à 3000 × g pendant 20 minutes, puis le surnageant S est filtré à travers un filtre de 0,22 micron. L'un des aspects clés d'AveXis tient au fait que, les protéines recombinantes étant sécrétées, elles peuvent être diluées ou concentrées afin d'atteindre des activités seuils. Nous avons observé que l'expression des protéines recombinantes varie jusqu'à quatre ordres de grandeur ; ainsi, l'étape de normalisation réduit l'apparition de faux positifs durant les étapes de criblage.

Pour commencer la normalisation de l'appât, la biotine non conjuguée doit être éliminée du milieu par dialyse, car elle entrerait en compétition avec la protéine d'appât biotinylée pour la liaison aux sites de liaison de la streptavidine. Commencez par placer l'appât dans un tube de dialyse. Pour assurer une dialyse efficace des protéines recombinantes, nous avons constaté qu'il est important de disposer d'une surface en excès pour le tube de dialyse. Généralement, nous utilisons deux à trois fois plus de tube que ce qui est strictement nécessaire pour le volume à dialyser.

Au cours d'une période de 24 heures, dialyser abondamment l'appât contre un tampon approprié tel que le PBS après la dialyse effectuée. Commencer un ELIZA en bloquant les puits d'une microplaque codée strep avec du PBST contenant de l'albumine de sérum bovin (BSA) pendant 15 minutes. Pendant ce temps, sur une plaque propre, préparer une série de quatre dilutions d'un tiers des protéines appât dans du PBST avec 2 % de BSA.

Après une incubation de 15 minutes, transférez la dilution sur la plaque codant pour la strep TTR et incubez la plaque pendant une heure à température ambiante. Après une heure, lavez les puits, puis ajoutez à chacun 100 microlitres de OX 68 à deux microgrammes par millilitre. Incubez la plaque à température ambiante pendant une heure supplémentaire. Après la seconde incubation, effectuez une autre série de lavages et chargez la plaque avec une anti-US phosphatase alcaline.

Incuber la plaque pendant une troisième heure à température ambiante. Laver ensuite la plaque trois fois avec du PBST et effectuer un dernier lavage au PBS. Pour éliminer tout détergent résiduel, ajouter 100 microlitres de substrat à 1 mg/mL 1 0 4 dans un tampon diéthanolamine après une heure.

À température ambiante, mesurez l'absorbance à 405 nanomètres. Une série de dilutions de quatre surnageants d'appât dialysés différents a été détectée par ELISA à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-étiquette CD4. Si les protéines d'appât exprimées non diluées sont insuffisantes pour saturer tous les sites de liaison de la biotine d'une plaque revêtue de streptavidine, concentrez la protéine à l'aide d'un concentrateur Viva spin. Sinon, utilisez la protéine d'appât à une concentration diluée dans du PBST contenant 2 % de BSA.

Cela suffit juste à saturer le site de liaison de la biotine dans le test. Quantifiez les niveaux relatifs d'expression des pré-protéines à l'aide de l'activité enzymatique de la bêta-lactamase. Commencez par préparer une série de dilutions du surnageant contenant les paraprotéines dans un tampon PBST avec 2 % de BSA.

Ensuite, ajouter 20 microlitres de la dilution à 60 microlitres d'une solution de nitrous stepin chargée dans une plaque. Transférer immédiatement la plaque vers un lecteur de plaques et mesurer l'absorbance à 485 nanomètres toutes les minutes pendant les 20 minutes suivantes à l'aide de concentrateurs centrifuges ou de PBST de dilution contenant 2 % de BSA. Régler la concentration finale des échantillons de manière à hydrolyser tous les nitros dans le test en environ sept minutes, soit environ deux cycles de turnover de nitros par minute.

Commencez le test AveXis en lavant une plaque revêtue de strep TAVR ENC dans du PBST et en tapotant la plaque contre une serviette en papier pour l'assécher. Ensuite, ajoutez du PBST contenant de l'BSA dans chaque puits et incubez la plaque pendant 30 minutes. Cette étape bloque les sites de fixation non spécifiques des protéines.

Dans chaque puits, nous éliminerons la solution de blocage par une légère secousse de la plaque au-dessus d’un évier et ajouterons 100 microlitres d’appât monomérique biotinylé normalisé dans les puits appropriés. Incuber la plaque pendant une heure à température ambiante. Ensuite, retirer les échantillons d’appât de la plaque par une autre secousse et les laver trois fois avec du PBST.

Ensuite, tapotez pour sécher après le troisième lavage. Ajoutez maintenant 100 microlitres du construct de proie pentamérique normalisé dans chaque puits et incubez la plaque à température ambiante pendant une heure. Après une heure, effectuez trois nouveaux lavages de la plaque avec du PBST et un dernier lavage avec du PBS uniquement.

Enfin, ajoutez 60 microlitres de la solution de nitrous seven dans chaque puits et incubez la plaque à température ambiante pendant deux heures, ou de préférence incubez les plaques pendant 16 heures à quatre degrés SIUs. Le lendemain, les interactions positives auront viré au rouge. Prenez une photographie de la plaque pour conserver un enregistrement visuel, puis quantifiez les réactions à une absorbance de 485 nanomètres à l’aide d’un lecteur de plaques.

Environ 10 minutes après le début de la réaction de criblage AveXis, des changements de couleur allant du jaune au rouge ont été observés à la fois dans le témoin de capture de l'élément cible par anticorps et dans l'interaction témoin positive. Ce changement de couleur indique l'hydrolyse du nitrite dans le substrat. Certaines interactions positives sont observables à cette échelle de temps, mais la plupart mettent quelques heures à apparaître.

Typiquement, un taux de réussite d'environ 0,4 à 0,6 % de positifs a été observé. Une fois les bibliothèques de protéines préparées, la phase de criblage de cette technique peut être réalisée rapidement. Il est tout à fait possible d'analyser jusqu'à 12 plaques en une journée après l'identification d'une interaction.

La prochaine étape la plus importante consiste d'abord à démontrer que l'interaction peut être répétée à l'aide de préparations protéiques indépendantes fraîches. Deuxièmement, nous déterminons systématiquement si l'interaction est indépendante de l'orientation appât-cible, c'est-à-dire si elle peut être réciproque. Cela implique le clonage des domaines du vecteur appât dans le vecteur cible et vice versa.

Les interactions qui peuvent être répétées et réciproques sont considérées comme étant de haute confiance et ont toujours été démontrées positives. En utilisant d'autres techniques telles que la résonance plasmonique de surface, nous aimons utiliser la résonance plasmonique de surface pour valider en outre toutes les interactions que nous réidentifions. De manière importante, cela permet de démontrer que les deux composants purifiés peuvent interagir directement et peut également être utilisé pour montrer que la liaison est saturable et donc spécifique.