Une technique de microscopie TIRF en temps réel, imagerie simultanée du TCR et de ses associés protéines de signalisation

Ce vidéo décrit une procédure permettant de suivre les événements de signalisation du récepteur des lymphocytes T à l'aide d'une acquisition simultanée à double canal. La microscopie de fluorescence par réflexion totale interne, ou microscopie TIRF, est utilisée pour observer des lymphocytes T transfectés avec un plasmide codant pour la protéine ZAP-70 marquée avec GFP. Une bicouche lipidique supportée sur verre, incorporant un peptide ancré par un lipide, des complexes peptide-MHC, des molécules d'adhésion et des molécules co-stimulatrices est préparée.

Les cellules T transfectées par ZAP 70 sont ajoutées à la bicouche lorsque les récepteurs des cellules T sont liés à des complexes peptide CMH. Les chaînes CD3 associées au récepteur des cellules T sont phosphorylées par la kinase LCK de la famille SARC, et la kinase ZAP 70 est recrutée depuis le cytoplasme. Le récepteur des cellules T est ensuite marqué par fluorescence et une imagerie est réalisée, au cours de laquelle les cellules sont immergées dans un milieu ayant un indice de réfraction inférieur à celui du verre de couverture et illuminées par un faisceau laser sous un angle subissant une réflexion totale interne.

Cela génère une onde évanescente à l'interface verre-eau, qui s'atténue exponentiellement dans le milieu, permettant une profondeur de pénétration de 100 à 200 nanomètres. Ainsi, seules les fluorochromes situés dans la membrane plasmique ou très près de celle-ci sont excités. L'analyse des images obtenues révèle que la signalisation a lieu dans des micro-amas de récepteurs des lymphocytes T.

Le principal avantage de la microscopie TIRF ou de la microscopie confocale classique est qu'elle permet d'obtenir une meilleure résolution, ce qui facilite la visualisation des agrégats de signalisation ou des complexes de signalisation tels que les micro-agrégats du TCR. Travis Crites et Chen, tous deux postdoctorants dans mon laboratoire, démontreront comment transfecter des lymphocytes T primaires de souris à l'aide de la technologie de nucléofection maximale, puis les observer par microscopie de fluorescence induite par réflexion totale (TIRF) après stimulation sur une bicouche lipidique déposée sur verre contenant un antigène.

Cette méthode a été largement utilisée pour étudier la signalisation dans diverses cellules immunitaires, notamment les cellules T, les cellules B, les cellules tueuses naturelles et les mastocytes. La méthode est largement applicable et peut être utilisée pour étudier la plupart des systèmes de récepteurs dans les cellules de mammifères, en particulier lorsque la signalisation se produit en agrégats. Les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés initialement, car les cellules T sont très difficiles à transfecter.

En outre, une coordination précise est nécessaire afin que la viabilité des lymphocytes T et l'efficacité de transfection, la qualité des billes ainsi que l'alignement du microscope soient satisfaisantes. La première étape de cette procédure consiste à transfecter des lymphocytes T primaires, soit naïfs, soit activés in vitro, avec des plasmides d'expression codant pour des molécules de signalisation marquées par la GFP, en utilisant un kit AM Maxa Mouse T-Cell Nucleo Effector. Tous les lymphocytes T utilisés dans cette étude exprimaient le TCR A-N-D qui reconnaît le peptide MCC présenté par la molécule du CMH IE de K. La procédure de transfection décrite ici est réalisée conformément aux recommandations du fabricant.

Cependant, certaines astuces sont présentées afin de favoriser la viabilité des lymphocytes T après la transfection. La viabilité et l'efficacité de transfection sont plus élevées chez les lymphocytes T activés in vitro que chez les cellules naïves ; par conséquent, ce protocole utilise des lymphocytes T activés in vitro avant de commencer. Préparez deux millilitres de milieu pour lymphocytes T enrichi pour chaque transfection en combinant 1,9 millilitre de milieu fourni dans le kit, 20 microlitres du composant A, 20 microlitres du composant B et 100 microlitres de sérum de veau fœtal dans un tube de deux millilitres.

Transférez deux millilitres de milieu dans chaque puits d'une plaque de 12 puits. Placez la plaque dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure afin de permettre l'équilibre du milieu ; une mort cellulaire résultera de la suspension des cellules transfectées dans un milieu froid ou n'ayant pas un pH de 7,2. Pour préparer le mélange de transfection, associez 82 microlitres de solution nucléaire pour lymphocytes T de souris avec 18 microlitres du supplément deux et cinq microgrammes d'ADN plasmidique sans endotoxine à une concentration d'au moins 0,5 microgramme par microlitre, en mélangeant soigneusement par tapotement.

Transférez cinq à dix millions de cellules dans un tube de centrifugation de 15 millilitres, centrifugez à 75 ×g pendant cinq minutes à température ambiante. Utilisez un aspirateur à vide pour éliminer autant que possible le surnageant, puis remettez doucement en suspension le culot cellulaire dans le mélange de transfection ; aspirez lentement le culot cellulaire trois à quatre fois jusqu’à ce qu’il ne reste aucun gros agrégat de cellules. À l’aide d’une pipette, transférez soigneusement la suspension dans un cuvet certifié Amaxa, en veillant à ne pas former de bulles.

Fermez le qve et sélectionnez le programme effecteur nucléaire X 0 0 1 sur l'appareil effecteur nucléaire. Insérez le vete dans le support Q vete et appuyez sur le bouton pour appliquer le programme sélectionné. Transférez ensuite immédiatement le vete et le milieu de culture prééquilibré dans la hotte.

À l’aide de la pipette en plastique fournie, ajoutez environ 500 microlitres du milieu pré-équilibré dans la cavité. Ensuite, ajoutez la suspension cellulaire au milieu contenu dans la plaque, goutte à goutte.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant quatre heures afin de permettre une faible expression des protéines marquées par la GFP et de minimiser l'apparition d'artéfacts dus à une surexpression. Dans cette section, une méthode d'alignement du microscope pour l'imagerie simultanée en deux canaux est décrite avant de mettre sous tension tous les composants du microscope. Allumer l'ordinateur et le logiciel.

Ensuite, vérifiez que tous les composants matériels sont reconnus par le logiciel. Puisque le logiciel démarre sans message d'erreur, tous les composants ont été détectés. Diluez un microlitre de sub-résolution.

Dispersez les microbilles multicolores Flores dans deux millilitres de PBS pour les utiliser comme étalon de colocalisation. Ajoutez ensuite 0,25 millilitre de la suspension de microbilles dans chaque puits d'un système de lamelle-chambre huit puits Lab Tech. Placez le système de lamelle-chambre sur la plateforme située au-dessus de l'objectif.

Ensuite, mettez au point les billes absorbantes sur la lame de verre dans l'aperçu en direct. Le volet gauche correspond au canal dans lequel les cellules transfectées avec GFP seront visibles. Le volet droit montrera le TCR marqué lors des expériences d'imagerie en temps réel sur cellules vivantes.

À l’aide du réglage d’alignement Y du coupleur de fibre XY, Z, ajuster la position du faisceau laser de manière à ce que le faisceau émerge de l’objectif et soit projeté sur le plafond. Il est important d’effectuer cette opération lorsque l’objectif se trouve dans la position où le plan en verre est au point. Si le faisceau sur le plafond est diffus, le faisceau n’est pas collimaté.

Régler le micromètre Z afin d'obtenir un test de collimation complet pour chacune des lignes laser utilisées dans l'expérience. Ensuite, à l’aide d’un wattmètre laser, régler la puissance laser entre 20 et 30 micro watts pour chaque canal. Les lymphocytes T sont extrêmement sensibles au rayonnement laser et l’illumination est limitée à un total combiné de 50 micro watts.

Ensuite, régler l'angle pour la pelouse. Tourner le micromètre d'alignement Y sur l'adaptateur de fibre pour déplacer le faisceau loin du plafond jusqu'à ce que son angle par rapport à l'axe optique de l'objectif s'approche de 90 degrés.

Une fois l'angle critique pour la réflexion totale interne atteint, la lumière du laser ne sort plus de l'objectif. Pour évaluer si l'alignement du gazon est correct, faites la mise au point en montant et en descendant à travers le plan du verre de couverture. Remarquez ici que, lorsque les billes adsorbées à la surface sortent du foyer, de nombreuses billes sont visibles en suspension dans la solution. Pour obtenir un bon alignement du gazon, il est nécessaire d'augmenter l'angle du faisceau par rapport à l'objectif.

À mesure que l'angle du faisceau augmente, les billes flottant près de la surface commencent à disparaître, tandis que l'intensité des billes absorbées à l'interface augmente. Lorsque les billes ajoutées et absorbées à l'interface sont maintenant sorties du foyer, aucune bille flottant en solution ne reste visible. À ce stade, le dispositif est correctement aligné, car seules les billes absorbées sur le couvre-objet peuvent être en.focus.

Ensuite, pour aligner les canaux fluorescents rouge et vert l'un par rapport à l'autre, focalisez-vous sur les billes et comparez la position des caractéristiques identifiables dans les images produites par les deux canaux. À l'aide des vis micrométriques X et Y sur un des supports de caméra, rapprochez au maximum la position relative des billes. Ici, observez la bille brillante située dans le quadrant inférieur gauche des deux images afin de garantir l'alignement spatial entre les deux canaux.

Cette caractéristique est amenée à la même position relative dans les deux images. Acquérir et enregistrer l'image provenant des deux canaux. Ces images serviront de référence de colocalisation pour aligner les deux canaux.

Un exemple de cet alignement est visible ici avant l'alignement. L'un des canaux est tourné par rapport à l'autre, comme le montre cette image dans laquelle les images des deux canaux des billes de résolution inférieure sont superposées. Après les réglages, les images sont alignées comme indiqué ici.

La qualité de l'alignement peut être davantage vérifiée en comparant les images de cellules vivantes transfectées par la GFP. Remarquez comment les podiums Laila provenant des deux canaux sont parfaitement alignés, après l'alignement des deux images à l'aide de l'étalonnage établi à partir des microbilles fluorescentes.

Une fois le microscope configuré, préparer des chambres à écoulement contenant des bicouches lipidiques supportées sur verre présentant un antigène, puis réaliser la microscopie TURF afin de visualiser en premier lieu les cellules T TRANSFECTÉES interagissant avec le substrat. Conformément au protocole décrit par Ana et Dustin, assembler une chambre à écoulement avec des bicouches lipidiques planes formées sur un couvre-objet en verre contenant des lipides NI NTA, la molécule d’adhésion ICAM-1 et des complexes peptide-MHC. Des IEFK chargés avec MCC sont incorporés dans la bicouche via des étiquettes histidine.

La molécule co-stimulatrice CD80 est incorporée. À l’aide d’un ancrage GPI, placez la cellule d’écoulement sur la platine du microscope et stabilisez-la en fixant la chambre à une plaque adaptateur sur la platine du microscope à l’aide d’une barre de tension afin de l’immobiliser. Ensuite, fixez l’élément chauffant fourni par le fabricant sur la cellule d’écoulement afin de contrôler sa température.

Positionnez l'objectif sur une bicouche et mettez le plan de la bicouche au point afin d'activer le chauffage de l'objectif et du dispositif d'écoulement ; allumez les chauffages du dispositif d'écoulement et de l'objectif pour porter la température de la chambre à 37 degrés Celsius. Après quatre heures d'incubation, transférez les lymphocytes T sectionnés dans un tube de 15 millilitres et centrifugez à une vitesse de 80 fois G. Resuspendez les cellules dans 300 microlitres de tampon H-B-S-B-S-A. Ajoutez ensuite le fragment FAB H 57 ou le fragment variable monochaine H 57 pour marquer le TCR à une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre pour le FAB ou de 20 microgrammes par millilitre pour le fragment variable monochaine.

Transférez les cellules dans un tube Falcon de cinq millilitres. Ensuite, à l’aide d’une seringue de un millilitre à embout conique, injectez les cellules dans la chambre d’écoulement via un robinet en té. Configurez les conditions d’imagerie de manière à ce que l’acquisition en direct sur deux canaux affiche un aperçu en temps réel des canaux TCR et GFP, puis repérez un champ contenant des cellules transfectées.

En raison des différences d'intensité entre le TCR et la GFP, il peut être nécessaire d'ajuster en temps réel l'échelle des images afin de visualiser les cellules dans les deux canaux. Comme c'est le cas ici, confirmez l'illumination en «turf» en mettant au point sur le plan en verre afin de détecter toute coloration latérale de la membrane. Si les membranes latérales ne deviennent pas nettes, l'alignement du «turf» est correct.

Dans cet aperçu en direct, la coloration de la membrane latérale est visible à la fois dans le plan de la lame et lorsque la lame est mise hors focus afin d'aligner correctement le microscope par rapport à la surface. L'angle du laser par rapport à l'objectif augmente et la membrane latérale sort du focus. Commencez à acquérir des images individuelles et des séquences en mode laps de temps avec un intervalle de 10 secondes.

Pendant cinq minutes, les cellules ont été incubées sur des bicouches supportées en verre et contenant six molécules par micromètre carré de peptide chargé d'IEFK, 100 molécules par micromètre carré d'ICAM-1 marquée par un tag histidine conjugué à l'Alexa 647 et 100 molécules par micromètre carré de CD80 ancré par GPI. L'acquisition simultanée en microscopie TIRF à deux canaux a été réalisée en présence continue du fragment Fab H57 marqué à l'Alexa 546.

Pour la coloration des cellules TCR, les cellules ont été observées jusqu'à une heure après le contact initial avec la bicouche. Le nombre d'agrégats de ZAP 70 par cellule a été analysé à l'aide d'un logiciel automatisé de comptage d'agrégats. Au moins 40 cellules ont été analysées dans chaque cas.

Les peptides chargés sont indiqués dans l'encart. ICAM un fait référence à des cellules sur des bicouches contenant 100 molécules par micromètre carré d'ICAM un marquée à l'Alexa 6 4 7 conjugué à une étiquette His. Comme le montre la figure, une signalisation dépendante de ZAP-70 se produit dans les microagregats du TCR et uniquement en réponse aux ligands agonistes, comme on peut le voir dans ce film, pris à raison de 10 secondes par image.

La signalisation du TCR en réponse à des peptides agonistes est maintenue par la génération continue d'agrégats microscopiques de TCR en périphérie de la zone de contact, qui recrutent ZAP 70. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment transfecter des lymphocytes T primaires à l’aide d’une technologie de transfection nucléaire maxa et correctement imager le recrutement de molécules de signalisation GFPT vers les micro-agrégats de TCR en utilisant la microscopie turf. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en sept heures si elle est exécutée correctement.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de manipuler délicatement vos cellules primaires. Plus les cellules seront saines à chaque étape de l'expérience, plus votre rendement de transfection sera élevé et plus vous obtiendrez de cellules en imagerie. Les lymphocytes T sont très mobiles, et par conséquent, l’imagerie séquentielle des canaux TCR et GFP entraîne un mauvais alignement des deux images en raison du déplacement des micro-amas de TCR et des cellules.

Pour surmonter ce problème, nous avons mis au point le microscope turf à acquisition simultanée sur deux canaux.