Imagerie multimodale d'implantation de cellules souches dans le système nerveux central de souris

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir un suivi standardisé du comportement in vivo de cellules souches transplantées dans le cerveau de souris. Cela est réalisé en marquant d'abord les cellules stromales dérivées de la moelle osseuse, qui expriment simultanément EGFP et la luciférase, à l'aide de particules d'oxyde de fer de taille micrométrique fluorescentes. La deuxième étape consiste à injecter de manière appropriée les CMO marquées avec les particules MPIO dans le tissu cérébral de la souris.

Ensuite, la survie et la localisation des greffes cellulaires sont suivies de manière non invasive par imagerie de bioluminescence et par imagerie par résonance magnétique. La dernière étape consiste à valider les résultats d'imagerie in vivo par une analyse histologique post-mortem. Cette méthode peut fournir des informations sur le comportement des cellules souches après transplantation dans le cerveau de la souris, mais elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les organismes modèles et les études de maladies.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les manipulations animales sont difficiles à apprendre, les injections intraveineuses et intracérébrales étant complexes à réaliser et comportant certains risques pour la survie des animaux. Pour commencer cette procédure, ajoutez 75 fois 10 à la puissance 6 particules d'oxyde de fer de taille micrométrique bleu glacé à une culture cellulaire en croissance subconfluente. Incubez pendant encore 16 heures afin de permettre l'absorption des particules par endocytose, puis éliminez les particules restantes par lavage.

Laisser les cellules croître pendant 24 heures supplémentaires afin d'obtenir une confluence cellulaire et une distribution homogène des G-B-M-P-I-O. Ensuite, utiliser la microscopie à fluorescence pour valider visuellement l'absorption des particules en calculant le rapport entre le nombre de cellules positives pour EGFP et G-B-M-P-I-O et le nombre total de cellules positives pour EGFP. Puis, laver deux fois les cellules BMSC luciférase EGFP marquées avec les G-B-M-P-I-O à l'aide de 10 millilitres.

Traitez les cellules au tripsin EDTA et récoltez-les par la suite. Ensuite, lavez les cellules et resuspendez-les à une concentration finale de 133 fois 10 à la puissance 6 cellules par millilitre dans du PBS. Enfin, maintenez les cellules sur de la glace jusqu'à la transplantation.

Dans cette procédure, anesthésiez la souris par injection intrapéritonéale d'un mélange de kétamine à 80 milligrammes par kilogramme et de xylazine à 16 milligrammes par kilogramme. Attendez cinq minutes que la souris s'endorme, puis rasez sa tête afin de permettre des manipulations stériles. Ensuite, placez la souris dans un cadre stéréotaxique et désinfectez la peau avec de l'alcool.

Ensuite, appliquer une pommade sur ses yeux pour prévenir la déshydratation. Réaliser une incision médiane du cuir chevelu afin d'exposer le crâne pour cibler l'hippocampe. Percer un trou dans le crâne à deux millimètres en arrière et à deux millimètres sur le côté à l’aide d’un foret dentaire.

À ce stade, vortexez brièvement la suspension cellulaire, puis aspirez la suspension cellulaire dans la seringue. Abaissez ensuite la seringue munie de l'aiguille à une profondeur de 2,5 millimètres sous la dure-mère et laissez équilibrer la pression pendant une minute. Après une minute, retirez l'aiguille jusqu'à une position située à deux millimètres sous la dure-mère.

Ensuite, injectez trois microlitres de suspension cellulaire à l’aide d’une pompe d’injection microautomatique à la vitesse de 0,70 microlitre par minute. Après l’injection, attendez cinq minutes supplémentaires afin d’éviter un reflux de la suspension cellulaire injectée. Ensuite, retirez lentement l’aiguille.

Ensuite, désinfecter les bords de la peau, puis suturer la peau. Injecter 300 microlitres de solution de chlorure de sodium à 0,9 % par voie sous-cutanée afin de prévenir la déshydratation. À la fin, placer la souris sous une lampe chauffante pour permettre la récupération de l'anesthésie avant de réaliser l'imagerie bioluminescente.

Anesthésiez la souris avec un mélange de 3 % d'iso, de fluorure et d'oxygène. Ensuite, placez la souris dans l'imagerie photonique. Réduisez le niveau d'anesthésie en ajustant le fluorure d'iso à 1,5 %. Puis injectez du d-luciférazine par voie intraveineuse à une dose de 150 milligrammes par kilogramme de poids corporel.

Acquérir une image pendant cinq minutes à l'aide du logiciel photo vision. Ensuite, effectuer le traitement d'image à l'aide du logiciel M three vision et quantifier le signal observé à l'aide de régions d'intérêt fixes. Pour réaliser l'imagerie par résonance magnétique, anesthésier la souris avec 3 % d'ISO fluoré dans un mélange d'oxygène et de protoxyde d'azote.

Ensuite, placer la souris dans le dispositif de contention d'un système d'IRM horizontal de 9,4 Tesla. Réduire le niveau d'anesthésie en ajustant l'isoflurane à 1 %. Appliquer ensuite un onguent sur les yeux de la souris afin d'éviter la déshydratation. Après cela, utiliser une sonde rectale pour surveiller la température corporelle.

Ensuite, placer un capteur sous le ventre de la souris afin de surveiller la fréquence respiratoire. Maintenir la fréquence respiratoire à 110 ± 10 cycles par minute et conserver la température corporelle constante dans une plage étroite de 37 ± 0,5 degré Celsius. Puis placer la bobine RF de surface au-dessus de la tête de la souris.

Positionnez la souris au milieu de l'aimant. Ensuite, ouvrez ParaVision 5.1 et réglez les paramètres de séquence conformément au manuscrit accompagnant. Puis, acquérez un ensemble de 10 images en écho de spin pondérées en T2 dans le plan coronal afin d'obtenir des informations anatomiques spécifiques.

Imagerie en écho de gradient pondérée NT à deux étoiles afin d'étudier la migration des cellules souches avec une résolution dans le plan de 70 micromètres carrés. À cette étape, sacrifier la souris et retirer le cerveau. Fixer le tissu cérébral à température ambiante dans du paraformaldéhyde 4 % dans du PBS pendant deux heures.

Après deux heures, déshydratez le tissu cérébral en le plaçant dans des gradients successifs de saccharose à quatre degrés Celsius. Le jour suivant, congélez le tissu cérébral à l’aide d’azote liquide et conservez-le à moins 80 degrés Celsius jusqu’à la coupe, au moment opportun.

Découper le tissu cérébral en sections de 10 micromètres d'épaisseur à l'aide d'un cryostat. Ensuite, observer au microscope à fluorescence les sections congelées non colorées afin de détecter la fluorescence bleue provenant des particules G-B-M-P-I-O et la fluorescence verte provenant des cellules exprimant l'EGFP. Puis, examiner les sections congelées non colorées afin de repérer la fluorescence de fond rouge-verte provenant des cellules inflammatoires.

La procédure de marquage décrite utilisant des MPIO bleu glacier permet un marquage hautement efficace des cellules BMSC, luciférase EGFP, que l'on peut facilement valider par microscopie à fluorescence. Ensuite, après la greffe de cellules BMSC marquées, luciférase EGFP, dans le SNC de souris, la survie de la greffe cellulaire peut être suivie par imagerie bioluminescente in vivo basée sur l'activité de la luciférase. De plus, la localisation exacte des cellules greffées peut être surveillée par imagerie par résonance magnétique in vivo fondée sur la teneur en fer des MPIO bleu glacier.

Enfin, l'analyse histologique montre la validation des résultats obtenus par imagerie bioluminescente et par imagerie par résonance magnétique. Une survie stable a été confirmée par une expression stable de l'EGFP au fil du temps après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'imagerie moléculaire pour explorer les événements cellulaires et moléculaires après la transplantation de cellules souches dans différents modèles animaux de maladies neurodégénératives.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer un imagerie moléculaire, en appliquant la bioluminescence et l'imagerie par résonance magnétique, et de valider adéquatement les résultats in vivo à l'aide d'une évaluation histologique post-mortem.