Mesure des variations de la concentration de calcium intracellulaire et de l'efficacité synaptique dans le mollusque

Le calcium intracellulaire est impliqué comme une composante importante de plusieurs mécanismes de plasticité synaptique. Ces hypothèses peuvent être testées en surveillant simultanément les variations de calcium et les modifications de l'efficacité synaptique. Nous montrons ici comment cela est réalisé en combinant l'imagerie du calcium avec l'enregistrement intracellulaire.

Nos expériences sont réalisées avec un ganglion du mollusque Aplysia californica. Ce montage présente plusieurs avantages, tels que des neurones identifiés de grande taille, des températures basses naturelles pour Aplysia, des signaux lents et une imagerie facilitée, mais les techniques générales que nous démontrons peuvent facilement être transférées à d'autres systèmes. Bonjour, je suis Colin Evans, au laboratoire d'Elizabeth Cropper, au sein du département de neurosciences Fishburg et de l'Institut cérébral Freedman à l'école de médecine Mount Sinai à New York.

Aujourd'hui, nous allons démontrer l'imagerie simultanée des variations de la concentration intracellulaire en calcium et de l'efficacité synaptique dans le ganglion buccal du mollusque Aplysia cahora. Pour détecter le calcium intracellulaire, nous injecterons dans un neurone pré-synaptique le colorant indicateur de calcium perméant à la membrane cellulaire, Calcium Orange. Le prélèvement est ensuite placé sous microscope et les neurones pré- et post-synaptiques sont piqués à l’aide d’électrodes pointues.

Une stimulation présynaptique répétée entraîne une réponse postsynaptique renforcée, visible sous la forme d'une augmentation du potentiel postsynaptique ou de l'amplitude du PSP. La mesure du signal fluorescent du colorant indicateur de calcium nous permettra de détecter des changements simultanés du calcium intracellulaire présynaptique. Pour commencer, anesthésiez un animal adulte pesant environ 150 grammes en injectant 75 mils de solution isotonique de chlorure de magnésium, fixez l'animal anesthésié sur une boîte recouverte de cire, puis, à l'aide de pinces et de ciseaux grossiers, pratiquez une incision dans le pied de l'animal et exposez la masse buccale.

Le ganglion buccal est situé sur la face ventrale de la masse buccale et se compose de deux hémiganglions reliés entre eux. Il contient plusieurs centaines de neurones qui, conjointement avec les neurones d'autres ganglions, participent à la génération et au contrôle du comportement alimentaire de l'animal. Libérez soigneusement le ganglion en sectionnant tous les nerfs repliés à l'aide de ciseaux fins, puis retirez-le de l'animal.

Ensuite, épingler le ganglion libéré sur le fond d'une boîte recouverte de silicone et remplie d'eau de mer artificielle. Le ganglion est entouré d'une gaine de tissu conjonctif, qu'il faut retirer pour exposer les neurones individuels. Utiliser des pinces fines, des ciseaux à iridectomie et faire preuve d'une extrême prudence pour découper cette gaine.

Pour éviter d'endommager les neurones, stabilisez le ganglion désenveloppé à l'aide d'épingles de quinze minutes, car tout mouvement posera problème pendant l'imagerie. Pour préparer des électrodes pointues destinées à l'enregistrement intracellulaire et à l'injection de colorant, tirez des capillaires à l'aide d'un tireur d'électrodes microscopiques. Nous utilisons du verre borosilicaté fin avec un filament, dont le diamètre externe est d'un millimètre.

Les électrodes d'enregistrement doivent avoir une résistance d'environ 10 méga lorsqu'elles sont remplies avec de l'acétate de potassium à trois molaire, et nous ajustons donc le puller en conséquence pour remplir les électrodes D. Plongez l'extrémité arrière de l'électrode étirée dans une solution à 10 millimolaire du colorant orange de calcium ; la capillarité entraînera le colorant le long du filament de verre à l'intérieur de l'électrode jusqu'à son extrémité, puis remplissez l'électrode par l'arrière avec du chlorure de potassium à 200 millimolaire afin d'assurer un bon contact électrique. Nous utilisons un Bela sur mesure pour améliorer les propriétés de l'électrode et réduire la résistance de l'électrode d'enregistrement à environ cinq méga.

L'électrode est maintenue à un angle de 45 degrés dans un flux de suspension d'oxyde d'aluminium. L'ajout de chlorure de sodium dans la suspension et la connexion d'un ohmmètre permettent de surveiller la résistance de l'électrode. Pendant le processus d'affûtage, nous transférons la boîte contenant les ganglions cœliaques vers un dispositif d'électrophysiologie et localisons les neurones d'intérêt en les piquant avec des électrodes et en vérifiant leur identité.

Pour préparer les neurones à l'imagerie calcique, nous insérons d'abord une électrode remplie de colorant dans le soma cellulaire et chargeons le colorant électrothériquement à l'aide d'impulsions de courant hyperpolarisantes de 15 nanoampères pendant 30 minutes. Au fur et à mesure que le D calcium orange pénètre dans la cellule, le SOR acquiert une teinte rose pâle. Nous rétractons ensuite soigneusement les électrodes d'enregistrement et laissons le prélèvement au repos pendant au moins 30 minutes afin de permettre au colorant de diffuser dans les prolongements fins du neurone.

Ensuite, transférez la boîte contenant le prélèvement vers un microscope à fluorescence. Nous utilisons un objectif à immersion dans l'eau de 10 fois, ouverture numérique 0,3, monté sur un microscope à plateau fixe droit, dont la mise au point s'effectue en déplaçant l'objectif et non le plateau. Cela facilite le montage des manipulateurs.

Pour les électrodes d'enregistrement, sélectionnez un bloc de filtres approprié. Un bloc de trois filtres SI fournira les filtres d'excitation et d'émission corrects pour le calcium orange ; réglez les paramètres de la caméra et l'intensité d'illumination à l'aide de filtres de densité neutre et du diaphragme de champ. Une intensité lumineuse plus élevée réduira le bruit, mais pourrait potentiellement blanchir le prélèvement.

La caméra CCD à obturation rapide peut capturer un champ de 500 par 300 pixels à une fréquence d'images d'environ 30 images par seconde, avec un bon rapport signal sur bruit. Minimisez l'illumination des neurones fil en gardant l'obturateur des sources lumineuses fermé chaque fois que possible. Dans le logiciel d'imagerie, sélectionnez les régions d'intérêt ou R ois.

Ces régions définissent les emplacements où le logiciel effectuera les mesures d'intensité. Nous réalisons généralement l'imagerie des branches primaires, secondaires et tertiaires du neurone présynaptique. Placez une ROI supplémentaire à côté du neurone difi afin d'obtenir une valeur de fond, qui sera par la suite soustraite de tous les autres points de données.

Des électrodes d'enregistrement intracellulaires dans les neurones pré- et post-synaptiques sont utilisées pour induire et surveiller la transmission synaptique. Vous pouvez assurer la synchronisation entre l'acquisition des données électrophysiologiques et celle des images en utilisant le signal de déclenchement de trame de la caméra pour démarrer le logiciel d'acquisition de données. Une autre méthode pour garantir la synchronisation consiste à monter une DEL dans le port de la caméra.

Cette DEL s'allume brièvement au début de la session d'enregistrement, fournissant ainsi une marque de synchronisation. Lors d'une expérience typique, vous déclenchez des potentiels d'action dans le neurone présynaptique en injectant de brèves impulsions de courant. Dans cet exemple, nous montrons un train de potentiels d'action et les augmentations correspondantes du signal calcique afin de tester des hypothèses spécifiques.

Le signal calcique peut être manipulé et les effets sur la transmission synaptique peuvent être déterminés. Par exemple, des médicaments tels que le chélateur calcique EGTA peuvent être injectés de manière présynaptique ou appliqués via le système de perfusion. Les données sont analysées en les exportant depuis le logiciel d'imagerie vers un fichier texte, puis vers le logiciel utilisé pour acquérir les données électrophysiologiques, qui, dans notre cas, est Spike2 de Cambridge Electronic Design.

Nous utilisons un script personnalisé pour tracer les valeurs d'intensité des ROI et les changements correspondants du potentiel membranaire, et quantifier les variations du signal calcique en soustrayant le signal de fond obtenu à partir du ROI de fond et en calculant la variation relative à l'aide de l'équation indiquée. F zéro correspond à la fluorescence juste avant la stimulation, et F représente la fluorescence durant la stimulation. Nous présentons ici les résultats d'une expérience dans laquelle nous avons observé les variations de la fluorescence calcique dans le neurone identifié B 21.

La région que nous avons imagée est indiquée dans A. Dans B un, nous avons induit un sursaut de potentiels d'action dans B 21, ce qui a provoqué des potentiels postsynaptiques dans B huit et une variation du signal calcique. B deux montre l'effet de l'injection du chélateur de calcium. Les potentiels d'action dans B 21 n'induisent plus d'augmentations étendues de la fluorescence calcique et l'amplitude du potentiel postsynaptique est réduite.

En conclusion, nous avons démontré des techniques permettant de surveiller simultanément la concentration intracellulaire de calcium et d'évaluer l'efficacité de la transmission synaptique. Ces techniques nécessitent un équipement modeste par rapport à la plupart des méthodes d'imagerie fonctionnelle et sont faciles et rapides à maîtriser.