Développement de la bronchiolite oblitérante dans un modèle murin de transplantation pulmonaire orthotopique

L'objectif général de cette procédure est de mettre en place un modèle de bronchiolite oblitérante reflétant une greffe pulmonaire orthotopique. Cela est réalisé en premier lieu en prélevant le poumon donneur d'une souris C 57 BL 10. La deuxième étape consiste à préparer la manchette pour l'anastomose de la bronche, de l'artère pulmonaire et de la veine.

Ensuite, le poumon donneur préparé est transplanté dans une souris receveuse C five seven BL six. La dernière étape consiste à observer la souris transplantée pendant 21 ou 28 jours après la transplantation. Enfin, une analyse histologique est utilisée pour révéler des lésions de bronchiolite oblitérante dans le poumon transplanté.

L'avantage principal de ce modèle par rapport au modèle de greffe hétérotopique avec effet miroir est qu'il reproduit la condition humaine. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car les structures supérieures chez la souris sont très délicates et plus sensibles aux lésions, étant donné que leur masse n'est qu'un dixième de celle du rat. Placez la souris donneur dans une chambre d'isolement hermétique et induisez l'anesthésie avec 5 % d'isoflurane. Ensuite, utilisez un cathéter intraveineux de calibre 20 pour intuber la souris ou la trachée, puis placez-la sur un ventilateur pour rongeur.

Continuer l'anesthésie avec 1 à 2 % d'isoflurane. Une fois confirmé que la souris est complètement anesthésiée par l'absence de réaction au pincement de la queue et des orteils, placer celle-ci en position supine et désinfecter l'abdomen avec de l'alcool à 70 %. Ensuite, inciser la peau recouvrant l'abdomen à l'aide d'une paire de ciseaux et exposer les muscles abdominaux.

Ensuite, réalisez une sternotomie lapar en effectuant d'abord une incision médiane à travers la paroi abdominale, puis en coupant transversalement le sternum, écartez les intestins et localisez la veine cave inférieure, située juste en dessous du foie. Injectez de l'héparine à raison de 100 microlitres par kilogramme dans la VCI. Ensuite, tirez vers le bas le ligament falciforme du foie et sectionnez le diaphragme le long de l'insertion caudale ventrale en direction de la colonne vertébrale.

Couper les deux côtés de la paroi thoracique jusqu'au cou afin d'exposer la cavité thoracique. Inciser la cage thoracique bilatéralement tout en protégeant le poumon, puis retirer le thymus. Ensuite, sectionner la VCI intrathoracique au niveau du diaphragme.

Localisez maintenant le cœur et excisez l'oreillette droite. Ensuite, pratiquez une incision transversale à la racine du tronc de l'artère pulmonaire et utilisez cette incision pour rincer les poumons avec deux millilitres de solution de Ringer lactate refroidie et 0,1 millilitre d'héparine. Exposez la trachée, puis sectionnez-la ainsi que l'œsophage.

Arrêtez maintenant la ventilation aux deux tiers de l'insufflation finale. Prélève le bloc cardiaque complet et conserve-le sur de la glace. Place un tampon de gaze sur le poumon prélevé pour le protéger de la lumière.

Inciser le ligament pulmonaire jusqu'à la veine pulmonaire ou pv. Retirer l'œsophage et l'aorte pour localiser le hile. Trouver l'artère pulmonaire ou pa, qui se situe à l'aspect le plus crânial du hile et au bronche principal attaché.

Disséquez soigneusement l'artère pulmonaire en la séparant du bronche. Ensuite, fabriquez un manchon artériel à partir d'un cathéter intraveineux de calibre 24 en le coupant à une longueur de 0,5 millimètre avec une extension de 0,7 millimètre. La surface du manchon est tressée AB.

Afin de fournir une surface pour l'anastomose, fabriquez un manchon pour le bronche en utilisant un matériau similaire à celui du manchon de l'artère pulmonaire, mais en prenant un cathéter de calibre 20 coupé à une longueur d'un millimètre avec une extension de 0,7 millimètre. La taille du manchon de la veine pulmonaire varie selon le poids de la souris donneuse. Pour les souris pesant de 24 à 27 grammes.

La taille du manchon est de 22 gauge, avec une longueur de 0,7 millimètre et une extension de 0,7 millimètre, pour des souris pesant entre 27 et 32 grammes. Les longueurs sont identiques, mais un cathéter de 20 gauge est utilisé. Insérez maintenant les manchons dans l'extrémité distale du faisceau artère pulmonaire, veine pulmonaire et bronche, en fixant chacun avec un fil de soie 9/0.

Une fois que les manchons ont tous été correctement fixés, enveloppez le poumon donneur préparé dans un tampon imbibé de solution de Ringer lactatée et placez-le sur de la glace jusqu'à la transplantation. Pour préparer la souris receveuse, induisez l'anesthésie et mettez-la sous ventilation mécanique de la même manière que pour le donneur.

Raser la paroi thoracique gauche et désinfecter avec de l'alcool à 70 %. Commencez par pratiquer une incision thoracotomique dans l'espace intercostal gauche troisième. Prolongez l'incision en direction dorsale, près de la colonne vertébrale.

Veillez à ce que le champ opératoire soit drapé de manière stérile et placez une pince pour micro-vaisseaux sur les vaisseaux pulmonaires et la bronche gauches adjacents au cœur. L'artère pulmonaire peut être visualisée à la partie crâniale, la veine pulmonaire à l'extrémité caudale du hile et la bronche entre les deux. Ensuite, appliquez une légère traction à l'aide d'un hémostat afin d'exercer une tension modérée sur l'AP, la VP et la bronche.

Laisser les structures hilaires pincées et résectionner soigneusement le poumon gauche. Isoler l'artère pulmonaire, la veine pulmonaire et le bronche, puis placer une suture en anneau lâchement autour de chaque structure. Disséquer complètement l'artère pulmonaire de sa gaine adventicielle, puis pratiquer une petite incision transversale d'environ un quart de la circonférence du vaisseau sur la paroi antérieure.

Tout en conservant intacte la poursuite de la partie dorsale de l'artère, récupérez le poumon donneur, enveloppé dans un champ de gaze stérile imbibé de solution de Ringer lactate froide, et positionnez-le dans la cavité thoracique. Ensuite, insérez les manchons dans l'artère pulmonaire (AP), la veine pulmonaire (VP) et le bronche du receveur afin de créer une anastomose, puis ligaturez-les avec un fil nano. Puis, retirez le poumon du receveur.

Ensuite, retirez la pince croisée hilarienne, ce qui permet la reperfusion et la ventilation. Replacez le poumon transplanté dans la cavité thoracique du receveur et fermez l'incision thoracotomique. À l’aide d’un fil de suture 5/0, la souris doit maintenant se réveiller de l’anesthésie. De la buprénorphine peut être administrée pour soulager la douleur une fois que la souris a recouvré conscience.

Ce tableau présente les scores histologiques du rejet aigu et la prévalence de la bronchiolite oblitérante ou BO. La notation du rejet aigu post-greffe est appelée score A. Les combinaisons d'allogreffes montrent une pathologie de rejet aigu ou chronique nettement plus importante par rapport à la greffe ISO. En outre, la prévalence de la bronchiolite oblitérante était significativement plus élevée dans les combinaisons d'allogreffes que dans la greffe ISO aux jours 21 et 28 après la greffe.

Les résultats macroscopiques et l'histopathologie à 28 jours après la greffe pulmonaire sont présentés ici. Ces images illustrent les aspects macroscopiques ainsi que les poumons greffés ISO colorés à l'hématoxyline et éosine (H et E) et le poumon droit témoin. Ces images représentent des colorations H et E et Masson trichrome de greffons pulmonaires BL10 transplantés chez des souris réceptrices BL6, ayant respectivement développé une BOS et l'absence de BOS.

La flèche blanche dans un B identifie les lésions d'OB. Ce panneau montre six greffons pulmonaires BL transplantés dans un receveur souris BL 10 une fois la maîtrise acquise. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en presque une demi-heure si elle est effectuée correctement.

L'utilité de cette technique réside dans sa capacité à répondre à des questions mécanistiques concernant la dysfonction primaire de la greffe, le rejet aigu et la bronchiolite oblitérante après une greffe pulmonaire.