Contrôle de la taille, la forme et la stabilité des polymères supramoléculaires dans l'eau

L'objectif général de l'expérience suivante est de contrôler la taille, la forme et la stabilité de nanoparticules dynamiques supramoléculaires dans l'eau. Ceci est réalisé par la conception d'amplifies dichroïques s'auto-assemblant ou polymérisant, dont la structure moléculaire est conçue pour présenter à la fois des interactions attractives et répulsives. Cela conduit à un mécanisme de croissance frustré produisant des nanoparticules auto-assemblées dans l'eau ayant une forme sphérique contrôlée.

En second lieu, la concentration en sel de la solution aqueuse est augmentée, ce qui affaiblit les interactions répulsives codées dans la structure moléculaire du disco amphi. Ceci induit une transition de sphère à bâtonnet ; des études spectroscopiques de dichroïsme circulaire (CD) dépendantes de la température sont réalisées afin de révéler les mécanismes sous-jacents à cette transition de sphère à bâtonnet. En outre, une combinaison de techniques analytiques telles que la microscopie électronique en transmission cryogénique et la résonance magnétique nucléaire sont utilisées pour mesurer et visualiser la transition d’un type d’agrégat à un autre. Les résultats obtenus montrent que la transition de sphère à bâtonnet se manifeste par un accroissement de la coopérativité dans la polymérisation supramoléculaire.

Cela provient d'une transition d'un processus anti-coopératif dans des nanoparticules de taille restreinte vers un mécanisme entièrement coopératif de nucléation-élongation, conduisant dans ce cas à la formation de très grands polymères supramoléculaires, à savoir des nanobâtonnets dynamiques. Le principal avantage de combiner des techniques spectroscopiques telles que la spectroscopie de dichroïsme circulaire, la diffusion d'angle faible des rayons X et la RMN avec des techniques microscopiques comme la cryo-microscopie électronique est qu'il permet de mesurer et de visualiser les transitions des polymères supramoléculaires dans l'eau. Ces polymères dynamiques peuvent répondre à des stimuli externes tels que des variations de température, des changements de force ionique ou des modifications du pH.

La combinaison de ces méthodes est largement applicable et peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la chimie moléculaire et des nanomatériaux auto-assemblés. Par exemple, on peut étudier la corrélation entre les dimensions des agrégats formés par l'auto-assemblage de petits blocs moléculaires constitutifs et les mécanismes de formation sous-jacents. Les implications de cette méthodologie s'étendent à un large éventail d'applications nano-biotechnologiques.

Nous nous intéressons particulièrement au domaine de l’imagerie biomédicale et au développement d’agents de contraste nano-particulaires auto-assemblés, où un équilibre délicat entre la stabilité des agrégats, le fort contraste et la capacité d’éliminer les agents de contraste auto-assemblés revêt une importance capitale pour leur utilisation clinique réussie. Nous avons eu pour la première fois l’idée de combiner des techniques de caractérisation lorsque nous avons réalisé que de subtiles modifications de la structure moléculaire des blocs constitutifs auto-assemblants pouvaient entraîner des différences fondamentales dans le mécanisme de polymérisation supramoléculaire. La procédure sera démontrée par Paul Beaumont, expert et responsable des installations cryo 10 à l’Université technique de Trovan.

Commencez ce protocole en préparant une solution de gadolinium DTPA BTA dans un tampon citrate 100 millimolaire, comme décrit dans le protocole écrit. En parallèle avec cette vidéo, remplissez une cuve UV Q d'un centimètre avec la solution. Insérez la cuve dans le support de la spectromètre circulaire D crowism.

Enregistrez un spectre de dichroïsme circulaire entre 230 et 350 nanomètres. Ensuite, enregistrez une courbe de refroidissement par dichroïsme circulaire au niveau de la bande de dichroïsme circulaire d'intensité maximale, entre 363 et 283 kelvins, à une vitesse d'un kelvin par minute. Puis, ajoutez le même volume de solution tamponnée de chlorure de sodium à deux molaire à la solution tamponnée au citrate de gadolinium DTPA.

Cela augmentera la force ionique à un molaire de chlorure de sodium et diluera les disques à la moitié de leur concentration. Vortexer la solution à force ionique accrue pendant 40 secondes après l'augmentation de la force ionique, puis mesurer à nouveau un spectre de dichroïsme circulaire entre 230 et 350 nanomètres. Ensuite, mesurer une courbe de refroidissement par dichroïsme circulaire à la bande de dichroïsme circulaire d'intensité maximale, de 363 à 283 kelvins, à une vitesse d'un kelvin par minute.

Exporter les données brutes de CD vers Origin 8.5. Normaliser les spectres en définissant l'effet CD à la température mesurée la plus élevée comme étant égal à zéro, et l'effet CD à la température mesurée la plus basse comme étant égal à un, puisque l'amplitude de l'effet CD est proportionnelle au degré d'agrégation ; les courbes de CD normalisées sont donc proportionnelles au degré d'agrégation. Les données normalisées sont ajustées à l'aide de l'option d'ajustement de courbe non linéaire dans Origin Pro 8.5, en utilisant un modèle d'auto-assemblage dépendant de la température.

Dans ce modèle, on distingue un régime de nucléation et un régime d'élongation. Commencez par ajuster le degré d'agrégation dans le régime d'élongation. Dans cette équation, T représente la température variable.

PHI N est l'hélicité nette, qui est proportionnelle au degré d'agrégation, et HE est l'enthalpie moléculaire d'élongation. T TE représente la température d'élongation, c'est-à-dire la température à laquelle l'auto-assemblage commence à devenir thermodynamiquement favorable. Le facteur de normalisation fiat est introduit afin de garantir que Phi N divisé par fiat ne dépasse pas l'unité, ce qui découle de la contrainte selon laquelle le degré d'agrégation ne peut pas excéder.

L'ajustement par le modèle de l'unité permet d'extraire l'enthalpie d'élongation en joules par mole et la température d'élongation en kelvins, qui caractérisent l'auto-assemblage des molécules pour une concentration donnée. Lors de l'ajustement, il convient de respecter la contrainte suivante : seul le degré d'agrégation aux températures inférieures à TE doit être ajusté, car l'équation n'est valable que dans le régime d'élongation. Après ajustement de la première équation, le seul paramètre inconnu dans l'équation du régime de nucléation est la constante d'activation ka, qui décrit le caractère coopératif de la polymérisation supramoléculaire. Pour déterminer la constante d'activation, ajuster le degré d'agrégation expérimentalement mesuré aux températures supérieures à TE, dans le régime de nucléation.

Commencez par préparer les solutions pour la microscopie électronique comme décrit dans le texte. Préparez brièvement deux tampons : un tampon citrate à 100 millimolaire et un tampon citrate à 100 millimolaire contenant cinq molaire de chlorure de sodium. Dissolvez du BTA au gadolinium DTPA dans 0,1 millilitre de chacun des tampons préparés afin d'obtenir une concentration finale de un millimolaire. Ensuite, traitez au plasma une grille en film quanti foil recouvert de carbone à l’aide d’un C Resington 2 0 8 carbon coer fonctionnant à cinq milliampères pendant 40 secondes.

La procédure de vitrification est une étape cruciale de la cryo, car elle garantit qu'une fine couche de glace vitreuse produite est adaptée à l'analyse par TAM. La solution aqueuse est appliquée sur la grille lors de la vitrification à l'aide d'un automate FEI Vitrobot. Cette étape comprend l'application de l'échantillon sur la grille, le tamponnement du liquide excédentaire afin de former un film mince de solution aqueuse sur la grille, puis la vitrification par immersion rapide de la grille dans de l'éthane liquide.

Après la vitrification, transférez la grille traitée dans de l'azote liquide pour la préserver, puis transférez manuellement la grille d'échantillon dans une cassette d'autoloader, elle aussi refroidie à l'azote liquide. L'étape suivante consiste à insérer la cassette dans le TUE cryo Titan, chargeur automatique de TEM. Le TUE Cryo Titan est équipé d'un canon à émission de champ fonctionnant à 300 kilovolts.

L'enregistrement des images TAM nécessite de l'expérience et une manipulation rapide. Cela s'explique par le fait que le faisceau d'électrons à haute énergie endommage l'échantillon pendant l'observation. Enregistrez les images à l'aide d'une caméra CCD équipée d'un filtre d'énergie post-colonne. Étant donné que le gadolinium est fortement paramagnétique et que les signaux protoniques seraient ainsi considérablement élargis, un disque différent a été utilisé, dans lequel le gadolinium a été remplacé par de l'yttrium diamagnétique et une solution de BT d'yttrium.

Le DTPA est préparé. Calculez combien de milligrammes de DTPA de BT atrium, dont la masse moléculaire est de 2 979 grammes par mole, sont nécessaires pour atteindre une concentration cible de un millimolaire. Procédez ensuite à la dissolution de la quantité déterminée de DTPA de BT atrium dans un tampon succinate désaéré à 50 millimolaires dans du D₂O, après avoir pipeté 0,6 millilitre de la solution obtenue dans un tube RMN de type Wilm, un LABAs.

Insérez l'échantillon dans une unité variante d'un spectromètre Nova 500 équipé d'une sonde I-D-P-F-G de cinq millimètres fournie par Varian. Réalisez les expériences DOI comme indiqué dans le texte, après avoir enregistré un spectre RMN standard du proton, adapté l'impulsion à 90 degrés et optimisé les temps de mélange en conséquence. La séquence d'impulsions DOI en une seule prise est utilisée après détermination de la diffusion propre du HDO dans la sonde de référence ovarienne, et dans l'échantillon, le coefficient de diffusion des agrégats est déterminé, à partir duquel le rayon hydrodynamique peut être calculé.

Enfin, calculez les rayons hydrodynamiques RH des agrégats en utilisant la relation de Stokes-Einstein pour la diffusion d'une particule sphérique. Le caractère ionique des complexes périphériques de gadolinium DTPA introduit une frustration dans la croissance unidimensionnelle des monomères disco dont le cœur est conçu pour polymériser en agrégats allongés de type bâtonnet. L'équilibre entre les interactions attractives et répulsives contrôle la taille et la forme des agrégats.

Une technique puissante permettant de déterminer la taille et la forme des particules en solution est la diffusion à petits angles de rayons X utilisant une source de synchrotron. Le gadolinium DTPA-BTA a été dissous dans une solution tampon au citrate et les profils de diffusion à petits angles ont été enregistrés à deux concentrations différentes.

Une pente tendant vers zéro dans la région de faible Q indique une absence de forme définie et une isotropie de l'agrégat, suggérant la présence d'objets sphériques. Les données mesurées à différentes concentrations ont été ajustées à l'aide d'un facteur de forme sphérique homogène et monodispersé, conduisant à un rayon calculé de 3,2 nanomètres. Le rayon géométrique calculé du monomère disco, BTA gadolinium DTPA, est de 3,0 nanomètres, ce qui, combiné à la présence d'agrégats présentant un rapport d'aspect proche de un, constitue une preuve supplémentaire de la forme sphérique et de la taille nanométrique des objets auto-assemblés.

Une spectroscopie RMN par diffusion ordonnée des protons a été réalisée. La RMN DOI permet de déterminer les coefficients de diffusion des agrégats supramoléculaires à partir desquels leur rayon hydrodynamique peut être calculé. Le coefficient de diffusion de l'agrégat diamagnétique dichroïque en solution tampon succinate deutérée a été déterminé à 0,69 × 10⁻¹⁰ m²/s par la relation de Stokes-Einstein.

Un rayon hydrodynamique de 2,9 nanomètres a été calculé pour les objets discrets de forme sphérique. Cette taille est en excellent accord avec la valeur obtenue à partir des données SOX pour le BTA au gadolinium DTPA. Des preuves supplémentaires d'un contrôle réussi de la longueur de l'empilement unidimensionnel ont été obtenues à partir de micrographies cryo-TEM.

Le DTPA au gadolinium BTA produit les objets sphériques attendus avec des diamètres proches de six nanomètres à une concentration de un millimolaire, ce qui confirme les résultats des mesures de so et de DOI. La formation de polymères supramoléculaires en forme de tiges présentant un rapport d'aspect élevé est clairement observée sur les micrographies cryo-te à forte force ionique. L'écrantage électrostatique constitue l'explication la plus probable de cette observation.

La forme passe d'un agrégat sphérique d'environ six nanomètres de diamètre à des tiges allongées de six nanomètres de diamètre et d'une longueur pouvant atteindre plusieurs centaines de nanomètres. Les spectres de dichroïsme circulaire à température ambiante du BTA au gadolinium DTPA, avec une concentration croissante de sel, sont présentés ici. La concentration en BTA au gadolinium DTPA est de huit fois 10 à la puissance moins trois millimolaire à faible force ionique et de quatre fois 10 à la puissance moins trois millimolaire à forte force ionique.

Bien qu'une concentration nettement plus faible soit utilisée pour les mesures de dichroïsme circulaire, l'effet coton prononcé indique la présence d'agrégats intacts même à des concentrations micromolaires. La forme du spectre de dichroïsme circulaire change lors de l'augmentation de la concentration en sel, ce qui constitue un bon indicateur d'une réduction des interactions répulsives en périphérie des empilements et d'un empaquetage accru des décors. De plus, les courbes de refroidissement en dichroïsme circulaire des mêmes solutions montrent des différences distinctes en termes de forme.

La température à laquelle commence l'agrégation augmente avec la concentration en sel. Un mécanisme de plus en plus coopératif devient également apparent, caractérisé par une augmentation plus abrupte de l'effet de dichroïsme circulaire, tandis que la courbe de refroidissement en absence de chlorure de sodium est mieux décrite par un modèle d'auto-assemblage ISO smique, indicatif d'un processus anti-coopératif. La courbe de refroidissement à 1,0 molaire de chlorure de sodium est typique d'un processus d'auto-assemblage coopératif et peut être décrite par un modèle de nucléation-élongation permettant de quantifier les paramètres thermodynamiques de l'auto-assemblage du BTA gadolinium DTPA à zéro et à un molaire de chlorure de sodium.

Utilisation d'un modèle coopératif révèle clairement la diminution de ka, qui est la constante d'activation sans dimension. Des valeurs plus faibles pour KA indiquent un degré plus élevé de coopérativité dans le processus d'auto-assemblage, ce qui se traduit par la formation de polymères supramoléculaires fortement allongés. Comme observé en cryo-TEM, lors de la mise en œuvre des techniques expérimentales démontrées, il est important de se rappeler qu'une combinaison de méthodes expérimentales permettra d'obtenir une description globale significative des nanomatériaux dynamiques étudiés.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la grande applicabilité de notre approche expérimentale combinée et de la manière dont elle peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des nanomatériaux auto-assemblés et des super poèmes.