Différenciation dirigée des cellules souches pluripotentes induites à l'égard des lymphocytes T

L'objectif général de cette procédure est de générer et de caractériser des lymphocytes T à partir de cellules souches pluripotentes induites ou cellules IPS. Les cellules IPS peuvent ensuite être différenciées in vitro dans un système de culture OP9-DL1, puis mûries in vivo chez une souris déficiente en rag. Alternativement, les cellules peuvent être modifiées génétiquement pour surexprimer le TCR OT1, puis transférées de façon adoptive afin de permettre leur développement in vivo.

Après six semaines de différenciation in vivo, les souris peuvent être soumises à une injection intrapéritonéale de sept cellules tumorales EEG, puis la spécificité antigénique des lymphocytes T dérivés des IPS peut être évaluée. En définitive, les cellules IPS peuvent se différencier en lymphocytes T conventionnels et en lymphocytes T spécifiques de l'antigène, ces derniers étant capables de protéger les animaux contre le défi tumoral. Les implications de cette technique s'étendent vers l'immunothérapie anticancéreuse individualisée.

La méthode permet de générer un grand nombre de lymphocytes T réactifs contre la tumeur à partir d'une quantité minimale de sang ou de tissu cutané du patient. Au jour zéro, transférer 5 × 10⁴ cellules IPS dans une plaque de culture de 100 mm contenant une monocouche confluente de cellules OP9-DL1, en milieu alpha MEM complété avec 20 % de SBF. Au jour cinq, faire une trypsine, puis centrifuger les cellules après les avoir incubées pendant 30 minutes dans une nouvelle plaque de culture de 100 mm à 37 °C. Plaquer 5 × 10⁵ des cellules en suspension dans du milieu alpha MEM contenant 20 % de SBF et du ligand de facteur de flétrissement murin (mouse Flt3 ligand), dans une nouvelle plaque de 100 mm contenant une monocouche de cellules OP9-DL1. Au jour huit, détacher délicatement les cellules faiblement adhérentes par pipetage, centrifuger les cellules, puis les transférer dans un seul puits d'une plaque de culture à six puits recouverte d'une monocouche confluente de cellules OP9-DL1. Incuber les cellules à 37 °C, 5 % CO₂, pendant deux semaines supplémentaires. Au jour 22.

Incuber les cellules IPS détachées dans du milieu frais sur une nouvelle boîte de culture à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, retirer environ la moitié des cellules en suspension et les faire passer à travers un filtre en nylon de 70 microns afin d'éliminer les agrégats cellulaires, puis laver trois fois le culot de cellules uniques obtenu avec du PBS froid. Après le troisième lavage, resuspendre les cellules dans du PBS à une concentration de 1,5 fois 10 à la puissance 7 cellules par millilitre et maintenir les cellules sur glace avant l'injection intraveineuse.

Placer une souris âgée de quatre semaines déficiente en rag sous une lumière infrarouge afin de dilater la veine de la queue. Ensuite, charger une seringue d'un millilitre équipée d'une aiguille de calibre 26 et demi avec 200 microlitres de la suspension cellulaire et transférer de façon adoptive les cellules par la veine de la queue dilatée. Trois semaines plus tard, après avoir confirmé l'euthanasie de la souris ayant reçu le transfert adoptif, prélever les ganglions lymphatiques et la rate après avoir dissocié mécaniquement les tissus.

Lysé la suspension de cellules uniques avec un tampon de lyse CK, puis lavez les mononucléocytes obtenus deux fois dans du PBS froid. Après coloration pour les marqueurs de surface cellulaire, analysez les cellules par cytométrie en flux au jour zéro ; utilisez le réactif de transfection JAMA pour transfecter, pendant la nuit, les cellules d’emballage plaquées E avec un OT un MIDR. Au jour un, semez un fois 10 à la puissance six cellules IPS dans un puits d’une plaque de 24 puits pré-enrobée de gélatine à 0,1 %. Au jour deux, récupérez le pseudovirus contenant la S natin provenant des cellules plaquées E, puis faites-le passer à travers un filtre de 0,4 micron afin d’éliminer d’éventuels contaminants après centrifugation. Transduisez les cellules en présence de polybrain pendant une heure à 330 fois g à 32 degrés Celsius.

Les incuber toute la nuit à la même température après avoir répété la procédure de transduction. Le jour quatre, traiter les cellules IPS transduites avec de la trypsine, puis, après centrifugation, resuspendre les cellules dans un milieu frais et les semer sur des cellules nourricières SNL 767 pré-codées et irradiées. Une fois que les cellules transduites ont atteint la confluence, trier les cellules doublement positives pour GFP et DSRed par cytométrie en flux.

Six semaines après le transfert adoptif des cellules IPS, injecter 50 microlitres de cellules EEG seven thoma dans la cavité péritonéale de la même souris au jour 50 du défi tumoral. Utiliser un kit d'isolement de cellules T CD huit positif Mil E Biotech pour trier les cellules T CD huit positives provenant de la rate et des ganglions lymphatiques de l'animal ayant reçu le transfert adoptif. Mélanger les cellules T CD huit positives isolées avec des cellules SPOC size irradiées provenant d'une souris C 57 black six J naïve selon un rapport de un pour dix, puis stimuler la co-culture avec 0,5 micromole par millilitre d'ova pendant 40 heures.

Ensuite, ajoutez le felden A aux cellules pendant quatre heures supplémentaires. Enfin, évaluez les populations cellulaires par analyse cytométrique en flux après avoir isolé les cellules SP d'une souris C57BL/6J naïve. Répartissez la suspension cellulaire en deux groupes.

Étiqueter le groupe CFSE élevé avec cinq micromoles par millilitre de CFSE et stimuler les cellules avec 10 microgrammes par millilitre de peptide ova pendant une heure ; étiqueter le groupe CFSE faible avec 0,5 MICROMOLE par millilitre de CFSE et ne pas stimuler. Mélanger 2,5 fois 10 à la puissance 6 cellules CFSE élevées avec 2,5 fois 10 à la puissance 6 cellules CFSE faibles dans du PBS. Ensuite, analyser les cellules par cytométrie en flux pour l'expression de CFSE.

16 heures après le transfert adoptif dans la souris d'intérêt, compter les cellules tumorales intrapéritonéales au jour 20 du défi tumoral. Utiliser une seringue de 10 millilitres équipée d'une aiguille de calibre 18 et demie et du PBS froid pour laver la cavité péritonéale. Compter les cellules tumorales récupérées afin d'identifier les cellules infiltrant la tumeur.

Prélèver la tumeur à un stade avancé du défi tumoral, puis couper la tumeur en trois morceaux. Placer le premier morceau de tumeur dans un tube cryogénique et poser le tube sur de la glace sèche. Fixer immédiatement le deuxième morceau au formaldéhyde.

Conserver le troisième fragment dans du milieu RPMI 1640 conditionné après avoir séché à l'air les coupes de tissu cryopréservées. Les fixer dans de l'acétone froide pendant 15 minutes après avoir séché à l'air les sections fixées pendant encore 15 minutes. Rincer les lames pendant cinq minutes dans du PBS après le rinçage.

Placer les lames dans une chambre humide et recouvrir les coupes de tissu avec 30 microlitres de 3 % B, SA et PBS pendant 30 minutes afin de bloquer la liaison non spécifique. Puis éliminer délicatement le tampon de blocage et incuber les coupes de tissu avec un mélange de 50 microlitres d'anticorps pe anti-TCR RV alpha deux et d'anticorps fitzy anti-ova, dilués dans du PBS contenant 3 % de PSA, dans la chambre humide pendant deux heures. À la fin de l'incubation, laver les lames trois fois dans du PBS froid, puis monter les coupes avec un milieu de montage aqueux avant l'examen en microscopie fluorescente pour l'analyse cytométrique en flux des lymphocytes T infiltrant la tumeur.

Disperser la tumeur en une suspension unicellulaire. Ensuite, analyser les cellules pour des marqueurs de surface spécifiques. Le CD3 et la TCR bêta sont utilisés comme marqueurs des cellules T afin de déterminer si la stimulation de cellules IPS avec le ligand Notch DL1 pouvait favoriser l'expression à la surface cellulaire des CD4 et CD8 sur les cellules dérivées des cellules IPS positives pour le CD3 et la TCR bêta.

Remarquez le diagramme de dispersion à droite, qui montre les lymphocytes T CD3+ TCRβ+ CD4- CD8+ à stade unique, générés à partir de cellules IPS in vitro. De plus, les cellules à stade unique dérivées de cellules IPS de la figure précédente ont produit de l'interleukine-2 et de l'interféron-γ lorsqu'elles ont été stimulées in vitro par des anticorps anti-CD3 fixés sur plaque et des anticorps anti-CD28 solubles, confirmant ainsi que les lymphocytes T dérivés de cellules IPS sont fonctionnels après transfert adoptif chez des souris receveuses. La majorité des cellules IPS transduites par le gène du TCR ont subi une différenciation en lymphocytes T cytotoxiques CD8+, qui ont répondu in vitro à une stimulation par peptides en sécrétant de l'interleukine-2 et de l'interféron-γ, comme le montrent ces diagrammes de dispersion réalisés à partir de cellules regroupées provenant de ganglions lymphatiques et de rate.

Des cellules T CD8 positives Vβ5 positives ont été générées chez des souris ayant reçu par transfert adoptif des cellules IPS transduites avec un TCR, mais pas chez celles ayant reçu des cellules IPS transduites contrôles. Les populations CD8 positives Vβ5 positives étaient positives pour la coloration intracellulaire des cytokines interleukine-2 et interféron-γ, représentées sur ces histogrammes par les lignes foncées, par comparaison avec les histogrammes témoins d'isotype ombrés, indiquant ainsi que les CTL dérivées des IPS étaient fonctionnelles. Ces données montrent que les cellules CFSE hautes, chargées avec un épitope et représentées par les pics à droite de chaque graphique, ainsi que les cellules témoins CFSE basses, représentées par les pics à gauche, ont été injectées chez des souris 10 semaines après le transfert de cellules IPS ou un jour après le transfert de CTL OVA-témoins.

Les CTL dérivés de cellules IPS spécifiques de l'antigène ont répondu à la stimulation par l'antigène et présentaient une activité cytotoxique, comme en témoigne l'absence de cellules CFSE élevées ici. Des cellules IPS transduites avec le gène de TCR OT1 ont été transférées de façon adoptive dans des souris C57BL/6, puis les souris ont été soumises à une injection de cellules tumorales EGG7 au jour 20 ; les cellules tumorales présentes dans la cavité péritonéale ont été dénombrées. Remarquez la réduction significative du nombre de cellules tumorales chez les souris ayant reçu les IPS transduites avec le TCR par rapport aux groupes témoins.

Plus important encore, le transfert adoptif de cellules IPS TRANSDUITES par un TCR a déclenché une infiltration de CTL hyperactifs dans les tissus tumoraux et a protégé les animaux contre un défi tumoral, comme observé sur cette coloration HES de tissus tumoraux prélevés entre les jours 30 et 35 après le défi tumoral, provenant de souris ayant reçu un transfert adoptif de cellules transduites par un TCR ou de CTL OT1, mais pas de souris injectées avec un contrôle factice ou témoin. Les cellules transduites présentaient une infiltration de cellules inflammatoires, indiquée par les flèches rouges ici. Des CTL spécifiques de l'ovalbumine, positifs pour V alpha deux (en rouge), ont été observés infiltrant les tissus tumoraux exprimant l'ovalbumine (en vert).

Alors que les tumeurs chez les souris des groupes témoins présentaient peu ou pas de cellules infiltrant la tumeur dans cette figure, des suspensions unicellulaires provenant de tissus tumoraux ont été analysées pour l'expression de la positivité V alpha deux et de la positivité V bêta cinq par cytométrie en flux, après sélection de la population positive pour CD8. Noter que les tissus tumoraux provenant de souris ayant reçu une transfusion adoptive de cellules IPS transduites par le TCR ont montré le niveau le plus élevé de cellules infiltrant la tumeur, tandis que les tumeurs provenant de souris ayant reçu des IPS transduites témoins n'ont montré aucune infiltration par des lymphocytes T spécifiques de l'ova et positifs pour CD8.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de générer des lymphocytes T spécifiques d'un antigène à partir de cellules IPS et d'évaluer les fonctions des lymphocytes T dérivés de cellules IPS.