Visualisation et analyse du flux sanguin et la consommation d'oxygène dans la microcirculation hépatique: Application à un modèle de l'hépatite aiguë

Un système optique a été mis au point pour visualiser la microcirculation hépatique à l'aide d'érythrocytes marqués au fluorochrome et pour mesurer la pression partielle d'oxygène dans les microvaisseaux par imagerie phosphorescente assistée par laser. Cette méthode peut être utilisée pour étudier les mécanismes physiologiques et pathologiques en analysant la structure microvasculaire, le diamètre, la vitesse du flux sanguin et la tension en oxygène. Dans la microcirculation hépatique, le sang circule des VE portales vers les VE centrales, créant un gradient d'oxygène entre les deux.

La concentration en oxygène dans le foie influence à la fois l'expression des enzymes et la pathologie, ce qui rend l'analyse du débit sanguin et la mesure de l'oxygène particulièrement importantes en recherche. Notre méthode expérimentale consiste à administrer par voie intraveineuse des globules rouges marqués avec un fluorochrome.

Afin de visualiser la microcirculation en utilisant la fluorescence pour la mesure de la pression partielle en oxygène, nous administrons par voie intraveineuse une porphyrine de palladium, qui émet une phosphorescence dans la circulation sanguine lorsqu'elle est excitée par un laser, avec une intensité dépendant de la concentration en oxygène environnant. Ce procédé permet une analyse quantitative de l'oxygène ; la mesure de la pression partielle en oxygène dans la microcirculation hépatique a révélé des valeurs de 59,8 et 38,9 millimètres de mercure au niveau portal et centrolobulaire, respectivement, démontrant ainsi une mesure efficace de la concentration en oxygène. Ensuite, nous avons appliqué cette méthodologie à un modèle de hépatite.

Nous avons observé une pression partielle en oxygène élevée dans les sinus portaux des ES et les ES centraux, mais une différence de pression réduite entre les ES portaux et centraux. Ceci est probablement dû à une consommation d'oxygène diminuée dans la zone veineuse centrale en raison d'une nécrose des hépatocytes. Ces résultats montrent que notre méthodologie utilisant un système optique pour mesurer l'hémodynamique hépatique et la consommation d'oxygène est capable d'élucider les mécanismes de diverses maladies du foie dans la microcirculation hépatique.

Le gradient d'oxygène est un paramètre essentiel impliquant l'expression des enzymes dans les régions périportales et paracentrales, ainsi que les types de maladies hépatiques liées aux micro-distributions ; il est donc important de quantifier le débit sanguin et la consommation d'oxygène. Pour clarifier les mécanismes, l'avantage de notre méthode réside dans la mesure optique non invasive et continue, qui permet de quantifier le flux sanguin, les diamètres des vaisseaux sanguins et le gradient d'oxygène dans la microcirculation hépatique. Du sang total a été prélevé sur une souris donneur et les érythrocytes ont été lavés deux fois avec du PBS par centrifugation à 400 G pendant cinq minutes.

Ensuite, dissolvez deux milligrammes de FITC dans un millilitre de phosphate monosodique désionisé à 100 millimolaire, avant de filtrer à travers une membrane de 0,2 micron de porosité. Placez ensuite un millilitre de solution de FITC dans un tube à essai avec 0,15 millilitre de solution de dextrane à 3 millimolaire, 0,25 millilitre de phosphate monosodique désionisé à 180 millimolaire et 1,5 millilitre de phosphate monosodique désionisé à 100 millimolaire, puis tapez légèrement pour mélanger. Laissez à température ambiante pendant deux heures avant de laver deux fois les globules rouges marqués avec du PBS.

Ensuite, déposez une petite quantité de suspension de GR sur une lame en verre et vérifiez à la fois l'aspect normal des GR et une fluorescence suffisante. Suspendez 0,1 millilitre de GR dans 0,9 millilitre de PBS et conservez à 4 degrés Celsius jusqu'à utilisation. Ensuite, dissolvez 500 milligrammes de BSA dans 10 millilitres de PBS. Ajoutez ensuite 30 milligrammes de porphyrine de palladium et agitez toute la nuit. Centrifugez la solution pour éliminer toute porphyrine de palladium non dissoute, puis filtrez le surnageant à travers une membrane de 0,2 micron. Répartissez un millilitre de filtrat dans des tubes à essai et stockez à moins 20 degrés Celsius. Veillez à éviter les cycles répétés de congélation-décongélation.

Pour visualiser microscopiquement la microcirculation, découpez un trou de 20 millimètres de diamètre dans une plaque en plastique et recouvrez-le avec un carré de lame couvre-objet de 30 millimètres de côté. Étalez le lobe hépatique principal sur une plaque en plastique en position ventrale après avoir canulé une veine de la queue. Ensuite, utilisez plusieurs morceaux de film plastique alimentaire mesurant trois millimètres sur huit millimètres pour couvrir la zone entourant le lobe, afin d'éviter les mouvements dus à la respiration et la dessiccation.

Visualisez la circulation hépatique à l’aide d’un microscope à transmission et confirmez qu’il n’y a pas de stase du flux sanguin dans le champ de vision pendant au moins 15 minutes. Pour observer progressivement le flux sanguin, injectez 0,2 mL de globules rouges marqués de manière fluorescente.

Pour mesurer la pression partielle d'oxygène, injectez 0,2 millilitre de solution de porphyrine de palladium. Les globules rouges marqués au FITC représenteront un cinquantième de l'ensemble des globules rouges en circulation dans la région visualisée ; excitez le FITC en l'irradiant avec une lampe à mercure passant à travers un filtre passe-bande de 450 à 490 nanomètres et enregistrez la fluorescence à l'aide d'une caméra CCD. La phosphorescence de la porphyrine de palladium est relativement faible et nécessite un détecteur à haute sensibilité ainsi qu'une pièce assombrie.

Les pics d'absorption de la porphyrine de palladium se situent aux alentours de 410 et 532 nanomètres, et la longueur d'onde du deuxième harmonique de 532 nanomètres est recommandée. Cette longueur d'onde est produite par un laser à impulsions au néodyme-YAG ; le faisceau laser est relié à un microscope inversé et ajusté de manière à ce qu'il éclaire le centre du plan focal. La résolution spatiale du laser dépend de la taille du spot, qui peut être ajustée en faisant passer le faisceau à travers un diaphragme.

Fixez un filtre passe-long et un tube photomultiplicateur au microscope afin de détecter la phosphorescence. Le PMT doit être sensible aux longueurs d'onde rouges, en particulier autour de 700 nanomètres. Échantillonnez le signal phosphorescent et calculez la constante de temps de décroissance en appliquant une fonction exponentielle.

Dans cette expérience, nous avons échantillonné 500 points à 200 kilohertz. Pour l'étalonnage, préparez deux solutions de porphyrine de palladium ayant une pression partielle d'oxygène de 150 et de zéro millimètre de mercure, respectivement. Pour la solution à zéro millimètre de mercure, ajoutez 1 % de dihi sodium aux échantillons afin de créer une condition où l'oxygène est absent pendant l'étalonnage.

Conserver un pH de l'échantillon de 7,4 et une température de 37 degrés Celsius. Placer la souris sur la platine du microscope et ajuster les microvaisseaux pour lesquels on souhaite visualiser la microcirculation hépatique au niveau du point du faisceau laser. Chez les souris ayant eu un accès libre à l'eau pendant la nuit, injecter de l'acétaminophène à 200 milligrammes par kilogramme par voie intrapéritonéale. Vingt-quatre heures après l'injection, anesthésier la souris et exposer le foie par une incision médiane. En cas d'hépatite, celle-ci sera facilement visible à l'œil nu par la nécrose dans la région paracentrale.

Notre mesure de la pression partielle d'oxygène et des microvaisseaux hépatiques chez la souris a révélé des pressions moyennes d'oxygène dans les veinules porte, les sinusoides hépatiques et les veines centrales de 59,8, 48,2 et 38,9 millimètres de mercure respectivement. Autrement dit, le gradient d'oxygène allant des veinules porte aux veines centrales indique un relâchement suffisant de l'oxygène par les hématies lors de leur passage à travers les sinusoides. Nous avons préparé des souris présentant une hépatite induite par l'acétaminophène afin de mesurer les microvaisseaux hépatiques.

À titre de modèle pathologique, nous avons constaté que les pressions partielles en oxygène dans les veinules porte, les sinusoides et les veines centrales étaient plus élevées dans le groupe traité à l'acétaminophène par rapport aux souris normales. La différence de pression partielle en oxygène entre les veinules porte et les veines centrales était de 20,9 millimètres de mercure pour les souris normales et de 16,9 millimètres de mercure pour les souris modèles de l'hépatite. La différence de pression partielle en oxygène entre les veinules porte et les veines centrales était de 20,9 millimètres de mercure pour les souris normales et de 16,9 millimètres de mercure pour les souris modèles de l'hépatite.

Le gradient d'oxygène dans la microcirculation hépatique provient principalement de l'apport d'oxygène par la veine porte qui est consommé par les hépatocytes ; la nécrose des hépatocytes dans la zone centrolobulaire induite par l'acétaminophène entraîne une diminution de la consommation d'oxygène, une microcirculation en aval perturbée et, par conséquent, des troubles liés à l'hémodynamique. L'apport et la consommation d'oxygène sont impliqués dans de nombreuses formes de maladies hépatiques. Nous avons établi un modèle d'hépatite aiguë et observé une augmentation de la tension en oxygène dans les microvaisseaux.

Notre système optique peut être utilisé pour étudier les mécanismes physiologiques et pathologiques en analysant la structure microvasculaire, ainsi que la distribution du flux sanguin et la consommation d'oxygène.