À haut débit de cartographie physique des chromosomes à l'aide automatisée

L'objectif général de cette procédure est de cartographier des sondes d'ADN sur les chromosomes de polytène de moustique à l'aide d'une préparation de chromosomes à haute pression, suivie d'une hybridation in situ fluorescente automatisée et d'un examen automatisé par imagerie. Cela est réalisé en préparant d'abord des préparations de chromosomes polytènes selon une méthode à haute pression. L'étape suivante de la procédure consiste à préparer des sondes fluorescentes en marquant l'ADN génomique complémentaire avec un fluorochrome par un protocole de traduction par entaille (Nick translation).

La troisième étape consiste à effectuer une hybridation in situ fluorescente en utilisant des systèmes automatisés de coloration de lames. La dernière étape est de numériser et de photographier les chromosomes marqués à l'aide d'un système d'imagerie fluorescente automatique. En fin de compte, les images peuvent montrer la localisation d'une sonde d'ADN marquée fluorescente sur le polychromosome.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme un protocole standard d'hybridation in situ manuel, est que le protocole de cartographie physique à plus haut débit produit des résultats plus reproductibles et réduit considérablement le temps de manipulation. Ce protocole commence par la dissection de femelles demi-gravité et oly environ 25 heures après l’alimentation sanguine afin de prélever leurs ovaires lorsqu’elles se trouvent au stade trois de Christopher. À ce stade, la zone transparente contenant les cellules nourricières à l’intérieur des follicules doit avoir une forme arrondie. Prélevez les ovaires de cinq femelles et fixez-les dans 500 microlitres d’une solution modifiée de carnoy fraîchement préparée.

Elles peuvent ensuite être conservées à température ambiante pendant un maximum de 24 heures ou plus longtemps à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, juste avant de préparer les lames de dissection ovarienne, préparez la solution de carnoy et de l'acide propionique à 50 %. Placez chaque paire d'ovaires dans une goutte de solution de carnoy fraîche sur une lame exempte de poussière, sous un microscope stéréoscopique.

Diviser les ovaires à l’aide de l’aiguille de dissection. Transférer tous les morceaux d’ovaires sur six lames propres contenant de l’acide propionique à 50 %. Séparer les follicules les uns des autres à l’aide d’aiguilles de dissection.

Ensuite, essuyez les tissus résiduels avec une serviette en papier. Ajoutez une autre goutte d'acide propionique à 50 % et attendez trois à cinq minutes. Selon la légende, les follicules plongés dans l'acide propionique à 50 % durant trois à cinq minutes présentent une amélioration significative de l'étalement chromosomique.

Ensuite, appliquez une lamelle et attendez une minute supplémentaire pour étaler les noyaux. Enveloppez la lame avec du papier filtre et du plastique. Réglez un Dremel entre 3 000 et 5 000 tr/min, puis, pendant environ une minute, faites tourner légèrement la pointe du Dremel contre la lamelle.

Vérifiez la qualité de l'étalement avec un microscope à contraste de phase et appliquez le dremel plus longtemps si nécessaire, afin d'aplatir les chromosomes. Placez une deuxième lamelle à côté de la première, puis placez les lamelles entre un autre microscope. Ensuite, enveloppez les préparations avec une feuille plastique et du papier filtre, puis placez les préparations enveloppées dans un étau pour comprimer les lames entre 85 et 120 pouces-livres.

Après avoir aplati les chromosomes sur les six lames, déroulez les lames et retirez les lames supplémentaires afin d'aplatir davantage les chromosomes. Incubez les lames à 55 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes dans un système de dénaturation et d'hybridation de lames. Ensuite, plongez une lame dans l'azote liquide pendant au moins 15 secondes ou jusqu'à ce que les bulles cessent.

Retirez ensuite rapidement la lame couvre-objet à l’aide d’un scalpel et placez immédiatement la lame porte-objet dans de l’éthanol froid à 50 % pendant cinq minutes. Répétez ce processus pour chaque lame porte-objet de manière séquentielle. Déshydratez les lames porte-objet dans des bains d’éthanol à 70 %, 90 % et 100 %.

Les immerger dans chaque bain pendant cinq minutes. Enfin, après séchage à l'air des lames, elles sont prêtes pour la coloration FISH. Un dispositif automatisé effectue la plupart des étapes de la procédure, à l'exception du marquage de la sonde.

Ainsi, avant de charger l'appareil, préparez la sonde fluorescente en marquant à nouveau l'ADN avec le fluorochrome en utilisant un protocole commercial de traduction NIC. Une fois la sonde préparée, chargez les lames et les réactifs dans les lames automatisées. Programmez le système pour effectuer les étapes suivantes. Premièrement, ajoutez 800 microlitres de un XPBS pendant 20 minutes.

Deuxièmement, séchez les lames à l’aide d’un sèche-cheveux. Troisièmement, fixez les lames avec 450 microlitres de formol à 4 % dans un XPBS pendant une minute. Ensuite, lavez les lames avec de l’éthanol à 100 % pendant une seconde, deux fois, puis pendant deux minutes.

Une fois après le bain d'éthanol, séchez à nouveau les lames à l'air. Chauffez maintenant les lames à 45 degrés Celsius pendant deux minutes afin d'éviter la formation de bulles. Appliquez ensuite 20 microlitres de la sonde d'ADN, suivis d'une goutte d'huile minérale et d'un couvre-objet ; puis dénaturez les chromosomes à 90 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ensuite, placer les lames en hybridation à 42 degrés Celsius pendant 14 heures. Après l'hybridation, effectuer les lavages de stringence pendant deux minutes à 42 degrés Celsius, suivis de quatre applications consécutives d'une seconde de deux XSSC et d'un séchage. Appliquer ensuite 800 microlitres de 0,4 XSSC à 42 degrés Celsius pendant 10 minutes, deux fois, puis réaliser un autre lavage avec deux XSSC à 25 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Appliquez maintenant la coloration : 50 microlitres de Yo-Yo-1, suivis d'huile minérale et de lamelles. Incubez les lames à 25 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, retirez les lamelles.

Lavez les lames deux fois dans du XSSC, quatre fois pendant une seconde par lavage, puis séchez les lames en les soufflant. Enfin, appliquez 15 microlitres de réactif antifade prolongé gold sur chaque lame et fixez de nouvelles lamelles. Mettez sous tension le système automatisé de numérisation Accord plus, en commençant par l'alimentation Olympus U-R-F-L-T pour une ampoule halogène.

Ensuite, allumez l'ordinateur, puis enfin le microscope équipé d'un appareil photo. Ouvrez d'abord le logiciel Duet, configurez un préscreening à 10 x. Cliquez sur le bouton en ligne, saisissez un nouvel identifiant de cas et attribuez un identifiant de lame.

Cliquez sur le point marqué bf. Il s'agit de l'option de champ clair. Sélectionnez un choix de numérisation pour un présat à 10 x.

Sélectionnez 2, 500 x cercle, 10 000 x cercle ou rectangle. Cliquez sur « définir » puis sur « exécuter ». Ensuite, suivez les invites pour ajuster correctement le balayage, puis cliquez sur « terminer ».

Pour démarrer l'analyse, appuyez sur l'onglet principal pour revenir à l'écran principal. Cliquez maintenant sur le bouton hors ligne, recherchez l'identifiant du cas et l'identifiant de la lame qui ont été attribués, puis cliquez sur hors ligne.

Numériser dans la zone noire située en haut à gauche. Cliquer sur une flèche et sélectionner la pré-numérisation 10 x. Utiliser les flèches pour parcourir les images numérisées après avoir trouvé une image intéressante.

Double-cliquez sur l'écran au milieu de la région ciblée, puis appuyez sur capture. Cela permettra de cibler une image pour une acquisition ultérieure, après avoir sélectionné toutes les cibles. Faites un clic droit sur chaque image, cliquez sur classer, sélectionnez pré-numérisation 10 x, puis sélectionnez polytan.

Retournez au menu principal et configurez le pré-scan 40 x. Sélectionnez à nouveau en ligne et choisissez une lame. Remplacez BF par ffl et modifiez le nom de la tâche en revisit dash X 40 dash rg.

Modifiez la section située juste en dessous du dernier paramètre pour revenir à l'ensemble du tableau de bord. Exécutez ensuite le programme et suivez les instructions. Pour configurer l'automatisation, cliquez sur le bouton Démarrer l'appariement des vues afin d'associer les images à 10 x et 40 x.

Cliquez sur « terminer » pour démarrer le balayage. Une fois terminé, cliquez sur « classer » et examinez les images. Des préparations de chromosomes polytènes de cellules nourricières ovariennes provenant de femelles d'anomalie de Gambie ont été réalisées à l'aide de la technique à haute pression.

Cette méthode n'endommage pas ou ne modifie pas la majeure partie de la structure chromosomique. Elle aplatit les chromosomes courbés et révèle ainsi des bandes fines cachées qui ne sont pas visibles sur des préparations classiques. Le chromosome a été sondé avec des clones d'ADN back obtenus à partir de la bibliothèque d'anomalie S Gambia nd Tam back.

La bibliothèque a été générée à partir de larves étoile de premier stade mâles et femelles de la souche de ravageur *Anopheles gambiae* S. Après cette procédure, un cartographage physique automatisé à haut débit peut être réalisé afin de faciliter le développement rapide d'assemblages génomiques basés sur les chromosomes.