Immobilisation planaire, l'irradiation partielle, et la transplantation de tissus

L'objectif général de l'expérience suivante est de positionner une population de cellules souches saines adjacentes à un tissu dont les cellules souches ont été éliminées, au sein d'un parian, afin d'analyser in vivo le comportement des cellules souches et de leurs progénitures durant la régénération. Pour ce faire, on anesthésie et immobilise un parian non irradié ou un parian irradié par feuille. Ensuite, le parian non irradié immobilisé est partiellement protégé par du plomb puis soumis à une irradiation aux rayons X, ce qui produit un parian non lésé présentant un tissu dépourvu de cellules souches adjacent à un tissu protégé qui conserve ses cellules souches.

Alternativement, une greffe de tissu prélevée sur un donneur non irradié peut être transplantée dans un hôte préalablement irradié afin de produire un parabionte possédant une population isolée de cellules souches, présentes dans un hôte dont les cellules souches ont été en grande partie éliminées. Les résultats obtenus montrent des populations isolées de cellules souches adjacentes à des tissus dépourvus de cellules souches, mis en évidence par hybridation in situ en montage complet pour les gènes marqueurs de cellules souches.

Ainsi, les méthodes décrites ici visent à mieux comprendre la régénération chez les planaires en étudiant le comportement des cellules souches dans deux paradigmes expérimentaux : la greffe et l'irradiation partielle, ce qui nous permet de tester si les tissus environnants et les microenvironnements locaux dans lesquels ces cellules souches résident influencent ou non le comportement de ces néoblastes ou cellules souches. Au cours du processus de régénération, un à deux mois avant l'expérience, nourrissez les plinaires conformément au manuscrit accompagnant. Afin d'obtenir la taille souhaitée dans cette démonstration, sélectionnez des plinaires mesurant entre un et deux centimètres de longueur et ayant une largeur supérieure à deux millimètres.

Ensuite, ils sont privés de nourriture pendant trois à sept jours avant utilisation. Préparez ensuite la solution de chloroforme, un anesthésique local doux, en dissolvant 0,1 à 0,2 % poids par volume de chloroforme dans de l'eau paraffinée. Refroidissez ensuite la solution sur de la glace pour la transplantation tissulaire avec un bec Bunsen, puis courbez un tube capillaire de 0,75 millimètre de diamètre intérieur à une distance d'un à deux centimètres de l'extrémité, selon un angle de 90 degrés, afin de découper le tissu greffé.

Ensuite, courbez un autre tube capillaire de 0,7 millimètre de diamètre extérieur à une distance d’un à deux centimètres de l’extrémité, selon un angle de 90 degrés, afin de créer un trou dans l’hôte pour recevoir la greffe. Ensuite, découpez le papier filtre noir Watman, le papier filtre Kimwipe numéro trois et le papier à rouler à cigarettes selon les dimensions indiquées dans le manuscrit joint.

Après cela, préparez la solution modifiée de Holt Fers et la solution saturée de Caine dans le réactif de Holt Fretter. Refroidissez les deux à quatre degrés Celsius. Ensuite, fixez un essuie-tout plié à un carré de Paraform.

Placez-le sur la plaque du refroidisseur Peltier ou sur un autre dispositif de refroidissement sous un microscope stéréoscopique. Ensuite, imbiber le chiffon Kim de solution froide de Holt Fretter. Puis, placez deux rectangles en papier filtre noir sur le chiffon Kim.

Placez maintenant un morceau de papier filtre Watman numéro deux dans une boîte de Pétri. Humidifiez le papier filtre avec la solution de Holt Fretter. Ensuite, refroidissez la boîte sur de la glace pour une irradiation partielle.

Placer un tampon en papier plus grand dans un plat plus grand, de manière similaire à la transplantation tissulaire. Humidifier le papier filtre avec la solution de Holt Fretter. Ensuite, refroidir le plat sur de la glace.

Dans cette procédure, remplir une boîte de Pétri avec une solution de cléone refroidie. Prélever les planaires à l’aide d’une pipette et les placer dans la boîte pour la transplantation. N’anesthésier qu’un hôte et un donneur à la fois.

Pour l'irradiation partielle, de nombreux animaux peuvent être anesthésiés simultanément. Laisser ensuite les paria tremper dans la solution de cléone pendant cinq à dix minutes, jusqu'à ce qu'ils deviennent immobiles. Rincer les paria en les pipetant dans une boîte remplie de solution Holt Fretter refroidie.

Après cela, immobilisez les embryons en les pipettant sur des papiers filtres noirs saturés de solution Holtfreter refroidie. Orientez-les alors avec la face ventrale vers le bas à l’aide d’une paire de pinces. Placez maintenant une boîte de Pétri refroidie, préparée précédemment, dans un seau rempli de glace, qui sera inséré dans un irradiateur X à source supérieure.

Disposez la zone de plin anesthésiée dans une boîte de Pétri en déplaçant les papiers filtres noirs. Ensuite, transférez-les vers la source supérieure de l'irradiateur à rayons X ; placez le seau à glace de sorte que la distance entre le tube cathodique et la paria soit minimisée, maximisant ainsi le débit de dose efficace.

Ensuite, positionner les écrans de plomb entre le paria et le tube cathodique pour la dose de rayons X. Si une ablution complète des cellules souches à partir des régions non protégées est souhaitée, administrer 30 grays ou plus. Immédiatement après l'émission de rayons X, transférer le parian dans de l'eau parian refroidie.

Après cela, laissez l’eau pariane atteindre la température ambiante et permettez aux animaux de se détacher du papier filtre noir. La procédure d’irradiation partielle est désormais terminée. Pour commencer cette procédure sous le microscope stéréo, disposez l’hôte et le donneur anesthésiés dans des zones distinctes sur des filtres noirs rectangulaires placés sur la lingette Kim, préalablement refroidie sur la plaque Peltier ou un bloc réfrigérant.

Utilisez un tube capillaire de 0,75 millimètre de diamètre intérieur pour prélever le greffon à partir du donneur. Ensuite, utilisez une paire de forceps pour le placer sur une zone latérale de l'hôte. Puis, utilisez un tube capillaire de 0,7 millimètre de diamètre extérieur pour retirer un plug de l'hôte.

Placer ensuite le greffon dans le trou. Transférer l'hôte greffé sur le papier filtre noir rectangulaire vers la boîte de Pétri préparée précédemment. Humidifier un morceau de papier roulant avec une solution de Holt Fretter saturée en Caine.

Ensuite, placez-le au-dessus de l'hôte transplanté. Trempez ensuite quatre morceaux de papier filtre contenant une solution saturée de Holter, et au cas où l'hôte transplanté s'assécherait, trempez quatre tampons découpés dans un essuie-tout Kim contenant une solution saturée de Holt Fretter. Disposez-les par-dessus les papiers filtre.

Après cela, fermez le couvercle. Placez la boîte de Pétri sur de la glace. Ensuite, transférez le parian donneur dans l'eau pariane pour récupération et régénération.

Lorsque toutes les greffes sont terminées, placer le parian greffé dans un incubateur à 10 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, le transférer dans une boîte de Pétri remplie d'eau de parian. Laisser le parian se détacher spontanément du papier filtre ou le retirer délicatement à l'aide de pinces, puis changer l'eau de parian une fois tous les deux à trois jours par la suite.

L'hybridation in situ par trou chez le parian fixé, irradié mais entièrement protégé, trois jours après l'irradiation, montre une distribution des cellules souches indiscernable de celle du parian de type sauvage. En revanche, pour le parian partiellement protégé, laissant les régions antérieure et postérieure exposées, les cellules souches semblent être éliminées des régions non protégées. Voici les vues dorsale et ventrale d'un parian ayant subi une greffe réussie.

Trois jours après la greffe, celle-ci est clairement visible sur les surfaces dorsale et ventrale, et est entourée d'un tissu caractéristique non pigmenté à l'interface hôte-greffe. En revanche, une greffe infructueuse ne présente aucun tissu greffé visible au site d'implantation. L'hybridation in situ sur préparation entière a révélé la présence de cellules souches uniquement dans la zone de la greffe ou autour de celle-ci, ce qui indique la réussite de la greffe une fois la technique maîtrisée.

Les transplantations peuvent être effectuées en aussi peu que cinq minutes chacune. Avec des taux de réussite avoisinant 90 à 100 %, et une irradiation partielle, le processus peut être considérablement amplifié, à supposer que la taille du champ de votre irradiateur soit suffisamment grande.