Préparer T facteur de croissance cellulaire à partir de splénocytes de rat

Bonjour, je suis Christine Beaton. Je suis chercheuse assistante dans le laboratoire de George Chen au Département de physiologie et de biophysique de l'Université de Californie à Irvine. Au cours des deux prochains jours, je vais vous montrer comment préparer le TCGF, acronyme de T cell growth factor.

Ainsi, pour notre culture cellulaire courante, lorsque nous n'avons pas besoin de connaître précisément la composition en cytokines du milieu de culture, nous utilisons un facteur de croissance pour les lymphocytes T, appelé surnageant TCGF provenant d'une culture de rate de souris Louis, qui contient les cytokines nécessaires au développement des lymphocytes T. La préparation du TCGF consiste à sacrifier des rats Louis sains, à prélever leurs rates, à préparer une suspension monocellulaire, à éliminer les globules rouges par lyse, puis à stimuler les cellules mononucléées avec de la concanavaline A, ce qui induit les lymphocytes T à produire toutes les cytokines nécessaires à leur croissance. Pour générer le TCGF, nous devons activer les cellules.

La méthode que nous utilisons consiste à ajouter de la lectine conval, abrégée en corona A, à notre culture cellulaire. Lorsque nous ajoutons la conc A à notre culture cellulaire, elle se lie au complexe du récepteur des lymphocytes T glycosylé, et en se liant à plusieurs complexes simultanément, elle provoque ce que nous appelons le « capping ». Elle provoque ainsi une agrégation, formant un regroupement de tous les récepteurs à la surface de la cellule, ce qui induit un signal d'activation dans les lymphocytes T.

Après l'activation des cellules, elles entrent en phase de blastulation. Elles grossissent, puis commencent à sécréter des cytokines. Initialement, nous pensions que le TCGF était principalement l'interleukine deux, mais nous savons désormais que ce n'est pas vraiment le cas.

Il contient également de l'interféron gamma, du TNF alpha et probablement aussi des cytokines en très faibles quantités, juste suffisantes pour maintenir les cellules vivantes après 48 heures. En culture, les cellules ont produit toutes les cytokines dont nous avons besoin. Nous allons donc éliminer les cellules et, une fois les cellules retirées et qu’il ne reste plus que le surnageant, nous aurons encore un peu de sérum fœtal libre dans le surnageant. Cela posera un problème, car nous souhaitons utiliser notre facteur de croissance des lymphocytes T pour maintenir la prolifération des lignées de lymphocytes T.

Et si nous laissons la conval libre dans le milieu, elle va activer les cellules alors que nous ne le souhaitons pas. Afin de résoudre ce problème, nous allons ajouter un excès d’un sucre qui va se lier à toute la conval libre dans le milieu. Elle sera ainsi complètement inactivée et ne pourra pas se lier à d'autres récepteurs glycosylés sur les cellules lorsque nous ajouterons le TCGF à la culture.

Commençons. La première étape de cette expérience consiste à prélever les splènes de rat immédiatement après l'euthanasie. C'est ce que je vais faire sans tarder en utilisant des instruments stériles.

Et une fois que j'ai prélevé les spléens, je vais les placer dans du PBS supplémenté avec des antibiotiques, et j'utilise de la pénicilline et de la streptomycine comme antibiotiques. Commençons donc. J'asperses donc le rat avec de l'éthanol à 70 % pour m'assurer de ne pas introduire de contamination dans ma culture.

Ensuite, à l’aide de mes instruments, je vais pratiquer une petite incision dans la peau ici. Puis j’enlève la couche musculaire et la rate apparaît juste ici. J’attrape alors une autre pince, et je tire délicatement la rate sans l’endommager.

J'enlève le tissu conjonctif de cette manière. J'ai donc maintenant une rate. Bien sûr, je fais très attention de ne rien endommager d'autre à l'intérieur de la cavité abdominale, car toute lésion de l'intestin entraînerait immédiatement une contamination de ma rate.

Ensuite, je vais transférer ma rate dans un tube contenant du PBS additionné d'antibiotiques. Ce tube est conservé sur glace. J'ai ainsi prélevé les rates de trois rats.

Nous sommes donc prêts à commencer et à préparer une suspension monocellulaire à partir de ces spléens. Maintenant que j'ai mes spléens, je les ai apportés dans une hotte de culture cellulaire afin d'obtenir une suspension monocellulaire en utilisant des tamis cellulaires de 70 microns. J'aurai donc besoin de plusieurs éléments pour préparer la suspension monocellulaire à partir des spléens.

J'ai besoin d'instruments stériles, d'une paire de forceps et d'une paire de ciseaux. Ensuite, j'ai le piston d'une seringue stérile de un millilitre dans la boîte de Pétri. Je vais placer mes spléens dans du PBS additionné d'antibiotiques.

Et dans une autre boîte de Pétri, j'ai placé un tamis cellulaire de 70 microns dans 10 millilitres de PBS additionné d'antibiotiques. La première étape consiste donc à s'assurer que les rates sont propres, car comme vous pouvez le voir ici, il reste de petits morceaux de tissu conjonctif que je vais retirer, puisqu'ils risquent de colmater rapidement le tamis cellulaire. Pour cela, je coupe simplement les parties indésirables et les jette sur le couvercle de la boîte de Pétri.

Maintenant, mes spléens sont en grande partie propres, donc je vais prendre les spléens un par un, les placer dans le tamis cellulaire et les découper en petits morceaux. Ensuite, j'homogénéise les trois prélèvements. L'étape suivante consiste à obtenir une suspension monocellulaire. Bien entendu, comme je souhaite tout garder stérile, je ne touche pas du tout au tamis cellulaire et j'utilise le piston d'une seringue stérile de 1 ml pour faire passer mes morceaux de rate à travers le tamis cellulaire.

Et comme vous pouvez le voir à l'extérieur du broyeur de cellules, une suspension de cellules uniques est en cours de préparation. Lors du premier passage, j'ai encore quelques petits morceaux de rate, mais je vais déjà prélever la suspension de cellules uniques. Je l'ai déjà transférée dans un tube de 50 ml que j'ai placé sur de la glace.

Et je vais recharger mon tamis cellulaire avec 10 mL supplémentaires de PBS contenant des antibiotiques. Je prélève donc environ 10 mL supplémentaires de mon PBS avec antibiotiques ; la précision n'est pas cruciale, nous effectuons simplement un lavage. Je l'ajoute au tamis cellulaire, puis j'applique la même procédure.

Je reviens à mon piston de seringue et j'appuie un peu plus à travers l'ocid. Bien sûr, vous n'arriverez jamais à tout faire passer, car il y a des tissus conjonctifs et de petits morceaux de graisse que je n'ai pas pu retirer et qui vont rester dans le tamis cellulaire. Mais vous devriez récupérer la majorité de votre rate dans le tamis cellulaire.

Ensuite, je répète exactement ce que j'ai fait précédemment. Je vais récolter ma suspension de cellules uniques et l'ajouter à la même dent. À ce stade, il reste presque plus rien du tamis dans le tamiseur à cellules, et le PBS qui en sort est beaucoup plus clair. Je vais simplement effectuer un dernier lavage, et nous devrions avoir récupéré la majorité des cellules à ce stade.

Je dispose désormais d'une suspension unicellulaire de PLE cytes et je vais les centrifuger simplement pour les concentrer. Une centrifugation de huit à dix minutes sera suffisante. Nous avons maintenant centrifugé nos PLE cytes et nous avons un culot bien défini.

Ce que je vais faire, c'est éliminer le surnageant, puis lyser les globules rouges. Je vais donc suspendre les myocytes dans du chlorure d'ammonium. Il s'agit d'une solution de chlorure d'ammonium à 0,15 molaire, et j'utiliserai cinq millilitres par rate.

Étant donné que j'ai trois spléens, je vais utiliser 15 millilitres de chlorure d'ammonium et je vais effectuer cette étape sur de la glace. Afin de lyser les érythrocytes, je vais pipeter doucement de haut en bas pendant trois minutes. Très bien, nous allons utiliser cette prise avec une exposition plus élevée ici.

À présent, j'ai analysé les électrocytes pendant trois minutes. Je vais remplir mon tube avec du PBS, ou vous pouvez également utiliser du milieu. Cela permet de ramener l'osmolarité de la solution à la plage normale pour les cellules.

Et je vais centrifuger les cellules comme je l'ai fait précédemment pendant huit à dix minutes afin de former un culot. Ensuite, je les laverai deux fois en utilisant le même PBS avec des antibiotiques. Nous avons donc centrifugé les cellules après l'isolement des électrocytes, et ne vous inquiétez pas, nous n'obtenons jamais une libération complète à cent pour cent des électrocytes.

Ainsi, le culot restera rouge, mais le surnageant sera plus clair. Ensuite, je vais vider le surnageant, redisperser le culot, ajouter du PBS jusqu'à 50 ml, centrifuger et répéter cette étape une fois supplémentaire afin d'effectuer deux lavages. Puis je pourrai effectuer le dénombrement. J'ai lavé mes myocytes deux fois, puis je les ai mis en suspension dans le milieu de culture et je les ai comptés à l'aide de votre cytomètre.

Comme prévu. À partir de trois spléens, j'ai obtenu environ 600 millions de cellules, ce qui est attendu puisqu'un spléen donne normalement entre 200 et 250 millions de cellules. Ce que je vais faire maintenant, c'est ensemencer mes cellules à raison de 2 millions par millilitre dans mon milieu qui a été complété avec 10 % de sérum de veau fœtal.

Et à ce milieu, je vais ajouter deux microgrammes par millilitre de concanavaline A pour stimuler les cellules. Ensuite, je vais simplement placer les cellules dans l'incubateur pendant 48 heures. Les cellules ont maintenant passé 48 heures dans l'incubateur et, comme je vais vous le montrer, elles se sont bien développées.

Le milieu est devenu orange. Nous sommes donc maintenant prêts à terminer notre préparation pour le TCGF. Comme vous vous en souvenez, j'ai ajouté du con carnaval à ma suspension cellulaire afin d'activer les cellules.

Ainsi, la concanavaline A est une lectine. Elle va se lier aux sucres présents sur tous les récepteurs des cellules T et va activer artificiellement toutes ces cellules. Le problème que nous avons maintenant est que nous avons encore un peu de concanavaline A dans le surnageant cellulaire.

Et comme nous allons utiliser un snat dans d'autres cultures de lymphocytes T afin d'agrandir les cellules, nous ne voulons pas que le con carnaval soit présent dans ces cultures cellulaires. Pour nous en débarrasser, je vais ajouter un excès de sucre auquel le con naval se lie, à savoir le méthyl alpha D-cyté, indiqué ici. Je vais ajouter un excès de ce sucre en le dissolvant complètement.

Il va se lier à toute la concentration restante de navale dans un. Une fois cela fait, je vais filtrer stérilement mes surnageants cellulaires et je vais congeler des aliquotes pour une utilisation au cours des prochaines semaines ou mois. Commençons donc cette dernière étape. J'ajoute mon surnageant de culture cellulaire à des tubes de 50 ml afin de pouvoir les centrifuger pour éliminer les cellules.

Je remplis donc simplement autant de tubes que nécessaire, et je ne le fais pas dans le hotte de culture ; je le pourrais, mais comme je dois de toute façon filtrer ma solution à la fin, car j'ajoute le sucre, qui n'est pas stérile, je le fais simplement sur la paillasse. C'est plus facile. J'ai maintenant versé toutes mes cellules et mon surnageant dans mes tubes Falcon de 50 ml.

Je vais donc les apporter à la centrifugeuse et les centrifuger pendant environ 10 minutes. La seule raison pour laquelle je les centrifuge est de former un culot cellulaire afin d'obtenir des surnageants clairs. Les cellules ont maintenant été centrifugées, le surnageant est donc clair et c'est ce que je voulais récupérer.

Je vais donc récupérer tout le surnageant dans un flacon propre de 150 centimètres carrés. À ce flacon, je vais ajouter le sucre. Pendant que les cellules centrifugeaient, j'ai pesé suffisamment de sucre pour en ajouter 15 milligrammes par ml de surnageant.

Je vais laisser complètement, entièrement dissoudre, puis je vais filtrer stérilement mon surnageant. Ensuite, je vais ajouter le sucre à raison de 15 milligrammes par ml de surnageant. Je remets le bouchon et, comme je ne travaille pas en conditions stériles, il n'est pas important si du milieu pénètre dans le bouchon ; je mélange jusqu'à ce que tout le sucre soit dissous.

Cela devrait être assez rapide. Oui, tout le sucre est maintenant dissous. Il me suffit donc de filtrer stérilement le surnageant, puis je vais le fractionner.

Normalement, je prélève des aliquotes de 10 à 15 ml que je conserve à moins 20 degrés. De telles aliquotes peuvent être stockées pendant plusieurs mois. Vous pouvez également conserver votre TCGF au réfrigérateur, mais dans ce cas, je le recommande d'utiliser dans les 10 à 15 jours suivants.

Au cours des deux derniers jours, je vous ai montré comment préparer le facteur de croissance des lymphocytes T, et ce surnageant est très simple à réaliser et très peu coûteux à préparer. Nous l'utilisons donc très fréquemment au laboratoire pour maintenir nos lignées de lymphocytes T en culture, sans avoir à acheter des cocktails coûteux de cytokines. Bonne chance dans vos expériences.