Purification par affinité des complexes virus de la grippe ribonucléoprotéiques de la chromatine des cellules infectées

Lyco brin négatif, virus à ARN. Le génome des virus de la grippe est empaqueté sous forme de complexes ribonucléoprotéiques viraux, ou VRNPs, dans lesquels le génome simple brin est encapsulé par la nucléoprotéine et associé au complexe polymérase virale composé des sous-unités PA, PB1 et PB2. Afin de purifier des complexes intacts à partir de cellules de mammifères infectées, des cellules HeLa sont incubées avec un virus de la grippe recombinant marqué par une étiquette strept.

Une fois que le virus pénètre dans les cellules, l'ARN viral est synthétisé dans les noyaux après infection. Les cellules sont ensuite lysées à l'aide d'un détergent et fractionnées en fractions cytoplasmique, nucléaire et chromatine par centrifugation, selon un protocole de fractionnement du chromatine basé sur l'assaut. Enfin, les VRP marquées par une étiquette strept sont purifiées par affinité à partir de chaque fraction. L'analyse de la composition en protéines et en ARN des VRP purifiées par coloration argentée démontre qu'à l'aide de ce protocole, même les VRP étroitement liées au chromatine peuvent être isolées de manière intacte. Ainsi, l'un des principaux avantages de notre protocole, comparé aux méthodes classiques de purification par affinité des complexes ribonucléoprotéiques du virus de la grippe, est qu'avec notre méthode, il est possible de purifier les VRP à partir du chromatine des cellules infectées, qui est connu comme étant le site de synthèse des ARNm du virus de la grippe.

Ainsi, notre méthode pourrait être utilisée pour répondre à des questions relatives à la régulation de la réplication et de la transcription virales, par exemple quels facteurs viraux ou cellulaires, mais aussi quelles modifications post-traductionnelles sont nécessaires, par exemple, à la synthèse des ARNm viraux ou également à la synthèse des ARN génomiques viraux. Par conséquent, les chercheurs novices dans cette méthode pourraient rencontrer certaines difficultés, car la fractionnement subnucléaire est très sensible aux conditions biochimiques et peut également varier considérablement entre différentes lignées cellulaires. Commencez ce protocole avec des cellules HeLa infectées par le virus de la grippe RWSN PB2 Strep, qui possède une étiquette Strep fusionnée génétiquement à l'extrémité C du sous-unité PB2, à une multiplicité d'infection de trois.

Lavez les cellules une fois avec du PBS froid, puis ajoutez 12 millilitres de PBS froid et détachez-les de la boîte. À l’aide d’un grattoir en caoutchouc, transférez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres et faites-les précipiter par centrifugation.

L'aspect le plus délicat de cette procédure est le protocole de fractionnement cellulaire. Les noyaux cellulaires sont très sensibles aux procédés d'homogénéisation et de mélange, et s'ils sont mal réalisés, ils peuvent facilement compromettre un extrait de chromatine. Il est donc très important de suivre non seulement les techniques d'homogénéisation, mais aussi les règles générales de manipulation des lysats, comme nous le montrons ici.

Après la centrifugation et l'aspiration, suspendre le culot cellulaire dans 10 millilitres de tampon au saccharose froid. Fixer une embout de pipette de 200 microlitres à une pipette en plastique de 10 millilitres et faire passer les cellules à travers celle-ci pour rompre les agrégats cellulaires. Incuber la suspension sur de la glace pendant 10 minutes.

Retourner périodiquement les cellules délicatement pour les resuspendre. Ensuite, ajouter du Non IET P 40 à une concentration finale de 0,5 % et vortexer à grande vitesse pendant 15 secondes, puis centrifuger immédiatement pendant 10 minutes à 3 500 ×g à quatre degrés Celsius dans une centrifugeuse de table. Après la centrifugation, éliminer le surnageant et le transférer dans un tube conique de 15 millilitres.

Conserver le surnageant à quatre degrés Celsius. Il s'agit d'une fraction cytoplasmique. Le culot doit être plus petit et plus blanc que le culot cellulaire d'origine, comme illustré ici.

Si le protocole doit être terminé ultérieurement, conserver le culot cellulaire à quatre degrés Celsius. Sinon, poursuivre en lavant le culot avec cinq millilitres de tampon de saccharose froid, puis centrifuger comme précédemment. Une fois la centrifugation terminée, éliminer le surnageant et resuspendre le culot, qui contient les noyaux, dans 1,5 millilitre de tampon froid d'extraction du plasma nucléaire.

Transférez le culot resuspendu dans un homogénéisateur en verre de 4 millilitres refroidi, muni d’un piston ajusté, et homogénéisez les noyaux à l’aide de 20 mouvements. En évitant la formation d’écume, la résistance doit augmenter après environ 10 mouvements. Pour confirmer un homogénéisation efficace, examinez l’échantillon au microscope à contraste de phase.

Les noyaux ne doivent plus être ronds, mais présenter des formes irrégulières et sembler avoir éclaté. Une fois les noyaux homogénéisés, les transférer dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Incuber l'homogénat sur une roue rotative à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.

Ensuite, centrifuger à 16 000 ×g dans une microcentrifugeuse pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, transférer le surnageant, qui correspond à la fraction plasmique nucléaire, dans un tube de 1,5 millilitre et le conserver à quatre degrés Celsius. Ensuite, resuspendre le culot dans 1,5 millilitre de tampon de digestion préchauffé à 37 degrés Celsius.

Incubez ensuite la fraction pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Ajoutez ensuite 42 microlitres de chlorure de sodium à cinq molaire pour obtenir une concentration finale de chlorure de sodium de 150 millimolaire, puis incubez pendant 20 minutes sur de la glace. Faites centrifuger à 16 000 ×g dans une microcentrifugeuse à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Après centrifugation, retirez le surnageant et conservez-le à quatre degrés Celsius. Il s'agit de la fraction CH1 50. Resuspendez le culot dans 1,5 millilitre de tampon froid à haute teneur en sel et incubez pendant 20 minutes sur de la glace.

Centrifuger à 16 000 × g dans une microcentrifugeuse à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Après la centrifugation, retirer le surnageant et le conserver à quatre degrés Celsius. Il s'agit de la fraction CH 500.

Sortez les fractions conservées pendant le protocole de fractionnement et placez-les sur de la glace. Ensuite, ajoutez 300 microlitres de chlorure de sodium à cinq molaire à la fraction cytoplasmique. Puis transférez 100 microlitres de billes Strep T in Sphero emballées par fraction dans un tube conique de 15 millilitres.

Ajouter 10 volumes de tampon de lavage strep aux billes. Inverser le tube pour mélanger et centrifuger pendant cinq minutes à 1000 ×g dans une centrifugeuse de table, puis jeter le surnageant.

Répétez le lavage avec le tampon deux fois, puis reprenez le culot dans un volume égal de tampon de lavage strep, ajoutez 200 microlitres de streptavidine liée aux billes en suspension à chaque fraction. Incubez les tubes en rotation pendant une heure à quatre degrés Celsius. Ensuite, centrifugez les tubes pendant une minute à 1000 × g et à quatre degrés Celsius, puis jetez le surnageant.

Ensuite, ajouter un millilitre de tampon de lavage sur les billes ayant incubé avec la fraction cytoplasmique dans un tube de 15 millilitres. Ajouter le tampon de lavage et transférer les billes dans un tube de 1,5 millilitre. Laver les billes pendant une minute, puis centrifuger les tubes pendant une minute à 1000 ×g à quatre degrés Celsius.

Répétez deux fois après la dernière étape de lavage. Éliminez toutes les traces de tampon de lavage à l’aide d’une pipette à embout plat. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon d’élution et mélangez doucement ; placez les tubes sur de la glace pendant 15 minutes.

Pendant l'incubation, mélangez occasionnellement les billes en tapotant doucement le fond des tubes. Après 15 minutes, centrifugez pendant une minute à 1000 × g à quatre degrés Celsius. Récupérez le surnageant contenant les VRP marqués par la strepteptavidine.

Il, nos cellules ont été infectées par la souche de virus de la grippe WSN pendant neuf heures, et les lysats fractionnés ont été analysés par immunotransfert comme indiqué ici. L'isolement doux du noyau extrait efficacement les protéines cytoplasmiques telles que la tubuline tout en évitant la libération de protéines nucléaires abondantes. Notez que la fraction chromatine extraite avec un faible taux de sel est enrichie en protéines importantes pour la transcription.

Bien que la fraction à haute teneur en sel contienne principalement des nucléosomes, afin de déterminer la composition protéique de la fraction cytoplasmique éluée, les VNRPs provenant de cellules HEK infectées pendant neuf heures par un virus non marqué, RWSN ou RWSN PB2 strep, ont été analysées par coloration argentée, comme illustré pour un éluat cytoplasmique. Ici, on observe un rapport élevé de NP par rapport à PA, PB1, PB2, comme en témoigne la bande majeure située au-dessus de 55 kilodaltons comparée aux bandes comprises entre 95 et 100 kilodaltons, ce qui suggère que la majeure partie du PB2 strep est purifiée dans le cadre d'un VNRN complètement formé, autrement dit, très peu de polymérase soluble est capturée. Pour comparer les rendements relatifs, les VNRPs purifiées après neuf heures d'infection par RWSN PB2 strep ou RWSN ont été colorées par l'argent, comme montré sur ce gel de coloration argentée. Les VRNPs peuvent être purifiés à partir des quatre fractions cellulaires après neuf heures d'infection.

La concentration la plus élevée de vRNP se trouve dans le plasma nucléaire, bien que des fractions importantes puissent également être purifiées à partir du cytoplasme et de la chromatine. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment purifier de hauts rendements de complexes ribonucléoprotéiques intacts de virus de la grippe à partir du noyau de cellules infectées. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'utiliser des tampons propres et d'éviter d'exposer inutilement les échantillons à la température ambiante, afin de prévenir à la fois la dégradation de l'ARN et des protéines, ainsi que la désassemblage des complexes protéiques.

N'oubliez pas que manipuler un virus de la grippe infectieux peut présenter des risques. Toutes les étapes doivent être réalisées sous une hotte de sécurité biologique de niveau deux jusqu'à l'ajout de NP-40 aux lysats.