L'isolement et la caractérisation des cellules dendritiques et les macrophages de l'intestin de souris

L'objectif général de cette procédure est d'isoler rapidement les cellules dendritiques ou DCs et les macrophages intestinaux de souris pour leur caractérisation phénotypique et fonctionnelle. Cela est réalisé en premier lieu par la récupération du tissu intestinal. La deuxième étape consiste à dissocier l'épithélium intestinal de la lame propre.

Ensuite, la lame propria intestinale est digérée lors des étapes finales de la procédure. Les cellules de la lame propria sont marquées par immunofluorescence à l’aide d’anticorps conjugués et triées pour des populations cellulaires spécifiques. En fin de compte, les populations de cellules dendritiques intestinales et de macrophages peuvent être caractérisées et purifiées plus précisément afin d’effectuer des études fonctionnelles évaluant la production de cytokines, la présentation d’antigènes et la régulation des cellules immunitaires.

Ainsi, le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans la rapidité de la digestion du tissu, qui garantit une expression optimale des antigènes de surface cellulaire, la viabilité cellulaire et ou les cellules. Après avoir euthanasié la souris et confirmé le décès par le réflexe de pincement de l'orteil, vaporisez de l'éthanol à 70 % sur l'abdomen et le thorax de l'animal. Ensuite, utilisez une paire de ciseaux pour pratiquer une petite incision horizontale au milieu de l'abdomen et relevez la peau afin d'exposer le péritoine.

Ouvrir le péritoine à l’aide de ciseaux après avoir incisé au niveau du sphincter pilore pour séparer l’estomac de la partie supérieure de l’intestin grêle, puis utiliser une pince pour détacher le mésentère. Effectuer une nouvelle incision au niveau de la valve iléocæcale afin de libérer l’intestin grêle entier du gros intestin. Continuer à disséquer le mésentère du gros intestin et pratiquer une incision au niveau de la marge anale.

Utilisez des ciseaux pour ouvrir le côlon longitudinalement et utilisez du C-M-F-P-B-S à température ambiante pour rincer les contenus fécaux et le mucus de la lumière intestinale. Ensuite, utilisez les ciseaux et la pince pour, macroscopiquement, disséquer les plaques de Peyer le long de la surface anti-mésentérique de l'intestin grêle, et ouvrez l'intestin grêle longitudinalement.

Ensuite, nettoyer la lumière de l'intestin grêle de son contenu fécal et du mucus à l'aide de plus de C-M-F-P-B-S à température ambiante. Parallèlement, découper les intestins grêle et grêle en morceaux d'environ 1,5 centimètre et placer les morceaux dans des tubes coniques individuels de 50 millilitres contenant 30 millilitres de C-M-F-H-B-S-S préchauffé avec du FBS et 2 millimolaire de EDTA. Placer chaque tube conique de 50 millilitres horizontalement dans un agitateur orbital, en agitant les tubes à 250 tr/min pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius.

Placez ensuite une passoire en fil métallique simple au-dessus d'un seau de déchets. Versez le contenu de chaque tube conique de 50 millilitres à travers la passoire afin de récupérer les morceaux d'intestin, puis placez-les dans de nouveaux tubes coniques individuels de 50 millilitres contenant 30 millilitres de Prewarm C-M-F-H-B-S-S avec FBS et 2 millimolaire de EDTA. Enfin, replacez les tubes dans l'agitateurmoteur orbital pendant encore 20 minutes.

Après le deuxième cycle d'agitation, versez le contenu de chaque tube à travers le tamis. Essuyez à nouveau délicatement l'excès de milieu à l'aide d'une serviette en papier, puis transférez les morceaux d'intestin dans un petit bateau en plastique pour lactosérum. L'aspect le plus délicat de cette technique est la digestion du tissu : pour assurer le succès, tous les paramètres différents tels que la durée de la digestion, les propriétés de la collagénase, l'intégrité du tissu et la taille du tissu à digérer doivent être pris en compte rapidement à l'aide de ciseaux.

Hachez les morceaux d'intestin, puis ajoutez l'intestin haché dans un tube conique de 50 millimètres contenant 20 millilitres de solution de collagénase. Placez le tube conique horizontalement dans l'agitateurboule et digérez les morceaux d'intestin à 200 tr/min pendant 10 à 20 minutes à 37 degrés Celsius. Vortexez brièvement le tube afin de garantir une dissociation complète des tissus intestinaux résiduels, puis filtrez la suspension cellulaire à travers un tamis cellulaire de 100 microns directement dans un tube conique de 50 millilitres.

Enfin, complétez le tube conique avec du C-M-F-H-B-S-S contenant du FBS et centrifugez la solution cellulaire deux fois pendant cinq minutes à 425 × g et à quatre degrés Celsius. Ensuite, versez délicatement le surnageant et resuspendez le culot cellulaire dans du C-M-F-H-B-S-S glacé contenant du FBS, puis placez les échantillons sur de la glace. Après avoir marqué les cellules pour les protéines membranaires d'intérêt.

Commencez par créer un diagramme en nuage de points en excluant les cellules positives pour la coloration des cellules mortes, comme illustré ici. Ensuite, excluez les événements doublets comme indiqué ici et ici. Utilisez maintenant les canaux de diffusion avant et latérale pour sélectionner les cellules d'intérêt, en veillant à exclure les débris.

Ensuite, créez un autre diagramme en points en ciblant l'antigène positif pour CD45 et positif pour IAB. Sur un diagramme en points distinct, représentant les cellules présentatrices, créez des régions permettant de distinguer les sous-populations spécifiques de DC et de macrophages. La région R1, indiquée ici, inclut les cellules positives pour CD11c et faiblement positives ou négatives pour CD11b.

La région R deux délimite les cellules qui présentent un niveau d'expression membranaire de CD11c similaire à celui des cellules de la région R un, mais qui expriment également CD11b. Les régions R trois désignent les cellules CD11b positives et CD11c faiblement négatives. Ces trois régions peuvent être analysées plus en détail pour l'expression de F4/80 et de CD103 afin de distinguer respectivement les populations de macrophages et de cellules dendritiques. Comme on le voit sur ce diagramme de dispersion, les cellules CD11c positives et CD11b faiblement négatives de la région R un expriment de forts niveaux d'alpha-CD103 et de faibles niveaux de F4/80.

Ce diagramme en points montre que les cellules CD11B positives et CD11C positives dans la région R2 seront composées à la fois de DC et de macrophages, en fonction de leur expression dichotomique de CD103 et de F480. Enfin, en se basant sur leur profil phénotypique F480 positif et CD103 négatif de la région R3, les cellules CD11B positives et CD11C délétées négatives sélectionnées seront constituées de macrophages. La relation entre la durée de la digestion tissulaire et le rendement total en cellules, ainsi que l'expression de CD11B et CD11C, est illustrée dans les six figures suivantes. Un tissu intestinal digéré pendant trois minutes donne un faible nombre total de cellules, ce qui se traduit par peu de DC et de macrophages disponibles pour la caractérisation. Une digestion tissulaire de 11 minutes produit un rendement élevé de cellules viables, permettant d'obtenir des populations de DC et de macrophages exprimant des niveaux élevés de CD11B et CD11C, phénotypiquement distinctes.

En revanche, une digestion de 50 minutes donne un rendement cellulaire similaire par rapport à la digestion optimisée. Toutefois, la délimitation des différentes populations cellulaires à l’aide de CD11b et CD11c devient plus difficile, car l’expression de CD11c diminue et le nombre de cellules mortes augmente.

Ainsi, après optimisation des paramètres de digestion du tissu intestinal, un rendement cellulaire élevé peut être rapidement obtenu. Par conséquent, l'isolement rapide des cellules dendritiques et des macrophages intestinaux de souris peut s'avérer utile pour évaluer les propriétés fonctionnelles des cellules immunitaires tout en préservant leurs antigènes de surface intacts.