Les petits extraits nucléaires pour les dosages fonctionnels de l'expression génétique Machineries

L'objectif général de l'expérience suivante est d'analyser l'expression génique à l'aide de machineries nucléaires fonctionnelles extraites de cellules. Pour ce faire, on commence par récolter les cellules HeLa en les faisant gonfler. Ensuite, les cellules sont lysées par ressuspension et centrifugées afin de former un culot de noyaux lors de la troisième étape.

Les noyaux sont extraits par le sel, concentrés et dialysés afin d'obtenir des machineries fonctionnelles de l'expression génique en solution. En fin de compte, la fonctionnalité des extraits nucléaires peut être évaluée en fonction de leur activité de transcription et d'épissage, mesurée à l'aide d'un système couplé de polymérase ARN pour la transcription et l'épissage. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la préparation d'extraits nucléaires en masse, est qu'elle permet d'utiliser une faible quantité de cellules pour préparer l'extrait nucléaire.

Commencez par ensemencer des cellules HeLa sur trois plaques de 150 millimètres avec un milieu DMEM supplémenté en FBS et en antibiotiques. Incubez les cultures dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 %CO2 jusqu'à ce que les cellules atteignent une confluence de 90 %. À ce stade, aspirez le milieu des cultures cellulaires HeLa et rincez-les une fois avec 13 millilitres de PBS à température ambiante par plaque, puis aspirez le PBS. Placez chaque plaque sur le côté pendant quelques secondes et aspirez le reste du PBS.

Ensuite, utilisez un détacheur cellulaire pour racler les cellules vers le bord inférieur de chaque plaque, puis transférez les cellules dans un tube Eppendorf de 1,5 millilitre. Enfin, faites tomber les cellules en culot dans une microcentrifugeuse pendant cinq minutes à cent fois G et à quatre degrés Celsius. Aspirez maintenant le PBS du culot cellulaire et estimez le volume cellulaire compacté ou VCC en observant les graduations sur le tube.

Ensuite, ajoutez un volume de tampon hypotonique égal au double du VGM au culot cellulaire. Agitez doucement le tube pour resuspendre les cellules. Passez délicatement la suspension cellulaire plusieurs fois dans une pipette de 1000 microlitres de haut en bas afin de dissocier les agrégats cellulaires si nécessaire.

Ensuite, faire un culot des cellules dans les mêmes conditions de centrifugation qu'auparavant. Après la centrifugation, aspirer soigneusement la couche tampon hypotonique. Les cellules auront commencé à gonfler et leur volume aura augmenté d'environ 750 à 1000 microlitres.

Ajouter du nouveau tampon hypotonique pour obtenir un volume final de 1,5 millilitre et resuspendre les cellules dans le tampon. Encore une fois, incuber les cellules gonflées resuspendues sur de la glace pendant 10 minutes pendant que les cellules refroidissent. Rincer un homogénéisateur en descente avec du tampon hypotonique, puis le placer sur de la glace avec les cellules.

Ensuite, à l’aide d’un essuie-tout délicat, comme un essuie-tout Kim, séchez le pilon. Utilisez une micro-pipette de 1000 microlitres avec une pointe allongée pour retirer le tampon des tubes. Utilisez maintenant la pipette pour transférer les cellules gonflées et refroidies dans le tube Down.

La partie la plus délicate de cette procédure consiste à vérifier avec succès la lyse. Après chaque homogénéisation, déplacer lentement le piston ajusté de l’homogénéisateur vers le haut et vers le bas cinq fois pour lyser les cellules, en prenant soin d’éviter la formation de bulles. Ensuite, transférer cinq microlitres d’une aliquote de la suspension cellulaire lysée dans un tube Eppendorf et ajouter 10 microlitres de bleu de trypan et 15 microlitres de PBS 1X.

Ajoutez la solution cellulaire sur une lame et observez les cellules au microscope optique afin de détecter une lyse ; les noyaux des cellules lysées apparaîtront bleus après trois onces. La lyse est insuffisante, car de nombreuses cellules vivantes sont visibles. Après cinq onces, la lyse est suffisante.

Transférez enfin les cellules lysées dans un tube Eppendorf prérefroidi et centrifugez la suspension cellulaire pendant cinq minutes dans une microcentrifugeuse à 1500 × g et à 4 °C. Ensuite, transférez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube sans perturber le culot. Maintenant, estimez le volume nucléaire du culot, ou PNV, en examinant les graduations sur le tube.

Remplir la pointe d'une micropipette avec du tampon à faible concentration saline à la moitié du volume de PNV. Ensuite, insérer la pointe de la micropipette dans les noyaux situés au fond du tube einor. Injecter lentement le tampon dans les noyaux tout en mélangeant délicatement.

Frapper doucement le tube pour s'assurer que le culot est complètement resuspendu. Ensuite, ajouter le tampon à haute teneur en sel à la moitié du volume de PNV et mélanger rapidement une seule fois en retournant le tube. Faire tourner le tube pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.

Enfin, centrifuger les noyaux dans la microcentrifugeuse pendant 15 minutes à 18 000 ×g et à 4 °C. Commencez par transférer 500 microlitres du surnageant dans des microtubes prérefroidis. Centrifuger l'extrait nucléaire à haut sel pendant 15 minutes à 14 000 ×g et à 4 °C ; après la centrifugation, retourner le mini-racon et le placer dans un nouveau tube EOR individuel.

Après une centrifugation de deux minutes à 1000 fois G et à quatre degrés Celsius, l'extrait nucléaire à haute teneur en sel sera concentré à environ 115 microlitres. Transférez maintenant des aliquotes de 45 microlitres de l'extrait nucléaire à haute teneur en sel dans des SLI de dialyse mini. Veillez à ce que le fond de la lame soit aligné avec le fond du flotteur.

Ensuite, placer les SLI dans 500 millilitres de tampon de dialyse refroidi. Enfin, agiter les aliquotes pendant une à deux heures à quatre degrés Celsius ; l'extrait nucléaire apparaîtra trouble après la dialyse. Cette figure présente des données représentatives comparant une réaction couplée de transcription par l'ARN polymérase deux et d'épissage dans un extrait nucléaire à petite échelle et dans un extrait nucléaire en masse.

Lorsque le construit A-C-M-V-D-N-A a été incubé dans des extraits en volume important ou à petite échelle, des niveaux similaires du pré-ARN naissant ont été synthétisés au point temporel de cinq minutes suivant l'ajout d'alpha et de manin pour bloquer toute transcription ultérieure ; les intermédiaires d'épissage et les produits d'épissage se sont accumulés au fil du temps avec des cinétiques comparables dans les deux types d'extraits. Ces résultats représentatifs confirment que les efficacités du système couplé de transcription par l'ARN polymérase II et d'épissage sont similaires dans les extraits nucléaires en volume important et à petite échelle. Afin de démontrer l'utilité de l'extrait à petite échelle, des extraits ont été préparés à partir de cellules HeLa traitées avec l'inhibiteur d'épissage E 7 1 0 7 ou le composé de contrôle négatif Platy analy F, puis un test couplé de transcription par l'ARN polymérase II et d'épissage a été réalisé comme illustré sur cette figure. La transcription par l'ARN polymérase II s'est déroulée efficacement dans les extraits préparés à partir des cellules traitées au plaid F comme à l'E 7 1 0 7.

En revanche, l'épissage s'est produit normalement dans l'extrait préparé à partir des cellules traitées par analy F, mais a été aboli dans les cellules traitées par E 7 1 0 7. Ces données constituent une preuve de concept pour l'utilisation d'extraits nucléaires à petite échelle après traitement particulier des cellules à petite échelle. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de cinq heures.