Constant procédé d'extrusion-pression contrôlée pour la préparation de vésicules lipidiques de taille nanométrique

L'objectif général de l'expérience suivante est de présenter une méthode de préparation fiable de vésicules lipidiques pertinentes sur le plan biologique. Cette méthode consiste à mélanger des phospholipides et à les transférer dans des vials en verre, puis à les hydrater avec un tampon aqueux afin de créer une suspension de vésicules multilamellaires (SLE). Dans un deuxième temps, une méthode de congélation-décongélation est appliquée, conduisant ensuite à la production de vésicules Ella à partir de vésicules multilamellaires.

Ensuite, la suspension de liposomes est passée dans un extrudeur en utilisant la pression optimale déterminée afin de produire des vésicules lipidiques homogènes d'une taille souhaitée. Les résultats obtenus montrent des tailles de vésicules submicroniques constantes, selon l'analyse par diffusion dynamique de la lumière et le suivi de nanoparticules. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la sonication et la sédimentation réside dans l'utilisation d'un système de contrôle de pression associé à des débits optimaux déterminés d'azote, permettant une préparation efficace des vésicules lipidiques selon la taille souhaitée.

Pour commencer cette procédure, prélevez un flacon en verre de 20 millilitres muni d'un bouchon à garniture en téflon, nettoyez tout le matériel en verre et les seringues avec du chloroforme avant utilisation afin d'éviter toute contamination. Transférez 100 microlitres de chloroforme de qualité réactif dans le flacon en verre à l’aide d’une seringue en verre étanche de 250 microlitres. Ajoutez 30 microlitres de méthanol de qualité réactif dans le même flacon en verre à l’aide d’une seringue en verre étanche de 100 microlitres.

Préparez une solution lipidique de cholestérol pop C à deux millimolaire en transférant 216 microlitres d'une solution de pop C à 10 milligrammes par millilitre, 42 microlitres d'une solution à 10 milligrammes par millilitre de pop E et 20 microlitres d'une solution de cholestérol à 11 milligrammes par millilitre dans un flacon en verre de 20 millilitres. Évaporez les solvants organiques à l'aide d'un flux lent de gaz argon ou azote jusqu'à l'observation d'un film mince de lipides au fond du flacon, puis placez le flacon en verre non bouchonné dans un dessiccateur sous vide pendant au moins 30 minutes.

Pour éliminer le solvant résiduel, transférez deux millilitres de tampon préalablement passé à travers un filtre de 0,2 micron dans l’ampoule en verre afin d’hydrater les lipides. Incubez le mélange à quatre degrés Celsius pendant la nuit et utilisez-le dans les 48 heures pour des liposomes de taille comprise entre 30 et 100 nanomètres. Congelez la suspension de liposomes dans l’azote liquide pendant 15 secondes.

Ensuite, décongeler la suspension de liposomes à l’aide d’un bloc chauffant à 42 degrés SIUs pendant environ trois minutes. Répéter le processus de congélation-décongélation pour un total de cinq cycles. La congélation suivie de la décongélation produit des vésicules unilamellaires à partir de vésicules multilamellaires et améliore l’efficacité de piégeage des lipides lors de l’extrusion.

Ensuite, préparez l'extrusion en suivant les instructions d'Avastin pour assembler soigneusement les liposomes aussi rapidement que possible. Un assemblage correct de l'extrudeur LF 50 est essentiel pour éviter les fuites d'azote, qui affectent les débits souhaités. Pour garantir la réussite, effectuez les étapes suivantes avec soin.

Pour obtenir un joint étanche à l'air. Placer l'écran de support à grande ouverture dans la base du filtre support, suivie du récipient circulaire central, d'un disque de drainage et d'une membrane en polycarbonate. Placer le petit joint torique noir par-dessus la membrane et le fixer solidement à la base du filtre support.

Fixez le filtre supérieur en serrant quatre vis dans les quatre trous correspondants. Assemblez l'unité de filtration sous le grand cylindre d'extrusion. Ajoutez la solution de liposomes dans le cylindre situé au-dessus du dispositif d'extrusion.

Placer un grand joint torique circulaire, un bouchon étroit, un autre grand joint torique circulaire et un bouchon circulaire. Fixer le régulateur de gaz sur la partie supérieure du corps de l'extrudeuse et fermer toutes les vannes pour éviter toute fuite d'air, y compris la vanne de décharge de pression. Placer un flacon en verre de 20 millilitres ou un ballon Erlenmeyer de 50 millilitres sous l'unité filtrante de l'extrudeuse.

Une soupape de sécurité est reliée au régulateur et s'ouvrira si la pression dépasse 600 PS.I. Mettez en marche le gaz azote et ouvrez la vanne de gaz connectée à l'extrudeuse. Augmentez la pression d'azote jusqu'à 25 PSI pour des liposomes de 400 nanomètres, jusqu'à 125 PSI pour des liposomes de 100 nanomètres, et entre 400 et 500 PSI pour des liposomes de 30 nanomètres. Observez la suspension de liposomes jusqu'à ce qu'elle soit expulsée dans le récipient sous la poussée de l'azote.

Conserver le flux d'azote jusqu'à ce qu'aucun liquide ne soit observé. Faire passer à travers le filtre de l'extrudeuse dans le flacon en verre pour effectuer l'analyse DLS. Préparer d'abord 50 microlitres d'une solution de liposomes à 20 micromolaire diluée dans du tampon salin phosphate ou PBS.

Ensuite, allumez la source d'alimentation et la source de lampe. Lancez le logiciel Dynapro. Configurez le logiciel sur le modèle d'algorithme permettant de détecter les liposomes à la taille souhaitée.

Après avoir prélevé à l’aide de la pipette automatique 14 microlitres d’échantillon de liposomes et l’avoir introduit dans la cuve en quartz, insérez celle-ci dans le porte-échantillon, puis appuyez sur démarrer. Après environ 20 à 30 acquisitions, appuyez sur arrêter. Analysez les pics du diamètre moyen des liposomes enregistrés sur l’histogramme. L’analyse par suivi de nanoparticules commence par la préparation d’une solution de liposomes de 500 microlitres à 0,1 micromolaire, solubilisée dans du PBS. Rincez le compartiment d’échantillonnage avec de l’eau et de l’éthanol.

Ensuite, séchez le compartiment d'échantillon avec un essuie-tout sans peluches. Allumez la source d'alimentation du laser et l'ordinateur, puis ajoutez 300 microlitres de solution de liposomes à 0,1 molaire dans le compartiment d'échantillon. Ouvrez le logiciel de contrôle de température et d'analyse de suivi des nanoparticules.

Appuyez sur le bouton de capture pour activer le laser. Utilisez les réglages horizontaux et verticaux pour déplacer la platine et ajuster la mise au point du microscope. Réglez la température souhaitée et la durée d'enregistrement.

Appuyez sur le bouton d'enregistrement pour capturer plusieurs images des particules de liposomes pendant une durée déterminée. Analysez les pics correspondant aux tailles de diamètre des liposomes sur l'histogramme, qui suit le mouvement de chaque particule. La DLS est une méthode établie qui recueille la lumière diffusée afin de déterminer le diamètre des particules et a été utilisée pour déterminer les tailles des liposomes.

Des liposomes hydratés ont été extrudés à travers des membranes en polycarbonate de tailles et de pressions variées, comme décrit dans le protocole écrit. Les diamètres des liposomes mesurés par DLS pour une taille de pore de 30 nanomètres étaient de 66 ± 28 nanomètres. Pour une taille de pore de 100 nanomètres, ils étaient de 138 ± 80 nanomètres, et pour une taille de pore de 400 nanomètres, de 360 ± 25 nanomètres.

Une suspension de billes de 50 nanomètres polies en irène a été utilisée comme étalon de calibration, donnant un diamètre enregistré de 47 ± 16 nanomètres. Le pourcentage de polydispersité indique qu'il n'y a aucun recouvrement entre les tailles de liposomes. Il est courant d'observer des diamètres supérieurs à 30 nanomètres lors de l'analyse par DLS en raison du biais connu de cet instrument en faveur des particules plus grandes.

Malgré cette limitation instrumentale, la courbe de calibration décrit une corrélation linéaire. L'analyse de suivi des nanoparticules est une technologie nouvelle qui mesure la taille de chaque particule à partir d'observations directes de la diffusion dans un milieu liquide, indépendamment de l'indice de réfraction ou de la densité des particules. Cette technique à haute résolution peut être utilisée pour compléter la mesure des liposomes par DLS ; les diamètres enregistrés par l'ANT de 95 ± 48 nanomètres et de 356 ± 51 nanomètres pour deux solutions de polystyrène de 100 nanomètres et 400 nanomètres ont été utilisés à des fins d'étalonnage.

Les solutions lipidiques présentent un diamètre plus comparable à celui obtenu par DLS, produisant des tailles moyennes de 29 ± 14 nanomètres pour une taille de pore de 30 nanomètres, de 95 ± 17 nanomètres pour une taille de pore de 100 nanomètres et de 359 ± 73 nanomètres pour une taille de pore de 400 nanomètres. La NAN pourrait être une technique de caractérisation plus générale pour quantifier les particules microscopiques, car sa sensibilité permet la mesure de particules comprises entre 50 et 1000 nanomètres. La courbe d'étalonnage montre une corrélation linéaire entre le seuil de la membrane en polycarbonate et le diamètre NTA enregistré. Les images de microscopie électronique en transmission avec coloration négative montrent que chaque taille de liposome après extrusion — 30, 100 et 400 nanomètres — est clairement distincte les unes des autres.

L'agrandissement a été réglé à 25 000 fois, la barre d'échelle représentant 0,5 micron. Une expérience cinétique a été réalisée avec trois tailles de liposomes. La DLS a été mesurée pour chaque solution de liposomes immédiatement après l'extrusion.

Toutes les solutions de liposomes ont été conservées à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Leurs diamètres ont été à nouveau enregistrés par DLS après une incubation nocturne. Peu ou pas de changement a été observé après une période d'incubation de 60 heures. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que plusieurs passages à travers le filtre d'extrusion amélioreront l'homogénéité de la solution de liposomes.

En outre, n'oubliez pas d'utiliser des vials en verre et des seringues pour la préparation des échantillons afin d'éviter toute contamination par lessivage provenant des tubes en polypropylène lors de l'utilisation du chloroforme.