Tridimensionnelle modèle de culture cellulaire pour mesurer les effets de l'écoulement des fluides interstitiels sur l'invasion tumorale

L'objectif de cette procédure est d'exposer des cellules cultivées en 3D à un écoulement de fluide interstitiel et de quantifier les effets induits par l'écoulement sur l'invasion cellulaire. Cela est réalisé en préparant tout d'abord une solution de gel composée de collagène de type I et de matrigel. La deuxième étape consiste à ajouter une concentration définie de cellules à la solution de gel.

Ensuite, la suspension cellulaire est ajoutée à un transwell de 12 millimètres de diamètre et de 8 micromètres de taille de pore, puis incubée à 37 degrés Celsius jusqu'à ce que la matrice prenne. La dernière étape de la mise en place du test consiste à ajouter des volumes précis de milieu dans les transwells afin de créer des conditions statiques et sous flux. Vingt-quatre heures plus tard, les membranes des transwells sont fixées, colorées et observées afin de quantifier le nombre de cellules ayant envahi.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les chambres à flux interstitiel microfluidiques, est qu'elle ne nécessite ni pompes ni équipement spécialisé, et permet aux chercheurs de tester facilement et rapidement plusieurs conditions ou traitements. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la migration et l'envahissement cellulaires, elle peut également être utilisée pour étudier l'effet du flux de liquide interstitiel sur d'autres comportements cellulaires pertinents, tels que l'expression des protéines, la prolifération cellulaire et les modifications de la signalisation cellulaire. La démonstration de cette procédure sera assurée par un LIMA deux chaa.

Un étudiant diplômé dans mon laboratoire commence cette procédure en plaçant un petit aliquot de matri gel sur de la glace à quatre degrés Celsius. Ensuite, préparez la recette du gel avec de l'eau stérile PBS, de l'hydroxyde de sodium, du matrigel et du collagène de type I de queue de rat. Puis mélangez les composants du gel sur de la glace dans le même ordre et incubez la solution finale pendant une heure à quatre degrés Celsius.

Placez maintenant un insert de culture cellulaire de 12 millimètres de diamètre avec huit micropores dans une plaque de 12 puits à l’aide d’une pince stérilisée. Ensuite, comptez les cellules et resuspendez-les dans un milieu sans sérum à une concentration de 5 × 10⁶ cellules par millilitre, puis ajoutez 100 microlitres de suspension cellulaire à 900 microlitres de solution de gel. Après cela, mélangez soigneusement en pipetant doucement plusieurs fois de haut en bas.

Ensuite, ajouter 150 microlitres du mélange final dans chaque insert. Puis transférer les inserts dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes, jusqu'à ce que le gel polymérise. Pour la condition statique, ajouter 100 microlitres de milieu sans sérum au-dessus du gel et 1 200 microlitres sous l'insert.

Les niveaux de fluide à l'intérieur et à l'extérieur de l'insert dans le puits doivent être approximativement égaux, ce qui entraîne une différence de pression minimale à travers le gel et l'absence d'écoulement interstitiel. Pour la condition d'écoulement, ajoutez 100 microlitres de milieu sans sérum sous l'insert et 650 microlitres au-dessus du gel. En même temps, veillez à éviter la formation de bulles d'air sous l'insert, car elles empêcheraient les cellules de migrer à travers la membrane à ces endroits.

Ensuite, placer la plaque dans une étuve à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. À cette étape, ajouter 500 microlitres de PBS une fois par puits dans une nouvelle plaque de 24 puits pour laver les inserts. Puis éliminer le milieu restant dans la partie supérieure des puits des inserts à flux dirigé.

Ensuite, utilisez des cotons-tiges pour retirer le gel des inserts. Essuyez la surface supérieure de la membrane afin d'éliminer les cellules non VA. Puis rincez les inserts en les plaçant dans la plaque 24 puits contenant du PBS à une fois pendant 15 secondes.

Après cela, retirez le PBS et ajoutez 500 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % sous chaque insert. Incubez pendant 30 minutes à température ambiante afin de fixer les cellules transmigrées. Ensuite, retirez le PFA et rincez une fois avec 500 microlitres de PBS pour éliminer le fixateur résiduel.

Ensuite, ajoutez 500 microlitres de solution de Triton X-100 à 0,5 % sous les inserts et incubez pendant 10 minutes à température ambiante. Pour permeabiliser les cellules, découpez les membranes à l’aide d’un rasoir. Puis, placez-les dans 100 microlitres de DPI à deux microgrammes par millilitre dans une solution de PBS 1x.

Veiller à placer la face inférieure de la membrane vers le bas. La solution de DPI doit être préparée quelques minutes avant utilisation et conservée à l'abri de la lumière. Enveloppez maintenant la plaque dans du papier d'aluminium.

Placez-le sur un agitateur à 150 tr/min pendant 30 minutes à température ambiante. Lavez ensuite les membranes avec 500 microlitres de PBS une fois et replacez-les sur l'agitateur pendant 10 minutes. Pour éliminer le jy libre, répétez le lavage deux fois supplémentaires.

L'étape suivante consiste à placer les membranes sur des lames de verre avec les cellules ayant subi une migration transversale orientées vers le haut. Ajouter la solution de montage sur les membranes, puis les recouvrir de lamelles.

Ensuite, comptez la coloration dappy par rapport aux noyaux et calculez le nombre de cellules envahies conformément au manuscrit accompagnant. Cette figure montre les cellules MDA MB 4 35 s ayant traversé la membrane. Les cellules envahies ont été fixées après le test d'envahissement par flux de liquide interstitiel et colorées au DPI et à la foidine conjuguée à l’Alexa Fluor 4 88 afin de faciliter le comptage des cellules envahies.

Il s'agit de la membrane en champ clair et voici les noyaux colorés par la coloration DAPI. Les filaments d'actine F marqués au fluorochrome Alexa Fluor 488 sont montrés ici. Ce graphique montre que l'invasion des cellules de mélanome métastatique MDA MB 435s est significativement augmentée par l'écoulement interstitiel.

Après 24 heures, les résultats sont normalisés par rapport à la moyenne de la condition d'invasion statique, et la moyenne provenant de six inserts de culture cellulaire est présentée. La différence entre les conditions est statistiquement significative avec une valeur P de 0,003. Une fois maîtrisé, le test de flux du liquide interstitiel peut être mis en place en deux heures, suivi d'une incubation de 24 heures, puis de deux heures supplémentaires pour la fixation et la coloration des membranes transverses.

Après cette procédure, les cellules, les protéines ou les acides nucléiques peuvent être facilement extraits afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la manière dont l'expression des gènes et des protéines évolue en réponse au flux de fluide interstitiel. Depuis son développement, cet essai est devenu essentiel pour les chercheurs étudiant les effets du flux interstitiel sur les cellules cancéreuses.