On-Chip phénotypage endothélium inflammatoire

L'objectif de cette vidéo est de présenter une technique de laboratoire sur puce permettant de caractériser l'état inflammatoire des cellules endothéliales. Pour commencer, des cellules endothéliales aortiques humaines sont cultivées jusqu'à confluence sur un substrat adapté à la culture tissulaire, puis insérées dans un dispositif de cisaillement de type plaque Conan. Les cellules sont traitées avec le cytokine pro-inflammatoire TNF alpha et simultanément exposées à des conditions contrôlées de contrainte de cisaillement pendant quatre heures, grâce à une rotation précise du cône situé au-dessus du substrat. La contrainte de cisaillement module ainsi une réponse inflammatoire bien documentée induite par le cytokine.

Cela inclut la surrégulation de molécules d’adhérence telles que VCAM-1 et ICAM-1. Le substrat est transféré sur la platine d’un microscope, où un dispositif microfluidique A-P-D-M-S est scellé sous vide directement sur la monocouche, créant ainsi des canaux d’écoulement. Des cellules monocytaire activées, lignée THP-1, sont acheminées sur le hs préconditionné, où elles s’attachent en proportion du niveau d’expression des molécules d’adhérence cellulaire.

L'état inflammatoire de l'endothélium est déterminé en quantifiant le nombre total de cellules THP-1 qui sont fermement arrêtées. Bonjour, je m'appelle She D Diverse, et je suis Greg Foster. Et je suis Keith Bailey.

Nous nous trouvons dans les laboratoires des professeurs Pastor et Simon, du Département de génie biomédical à l'Université de Californie à Davis. Aujourd'hui, nous allons décrire l'utilisation d'une approche basée sur un laboratoire sur puce afin d'examiner de manière quantitative le dysfonctionnement endothélial et l'inflammation. Ces outils fournissent une plateforme nous permettant de mener des études relatives à la superposition du stress métabolique avec des facteurs hydrodynamiques, ainsi qu'à la régulation du phénotype inflammatoire endothélial et de la susceptibilité à l'athérosclérose.

Ainsi, nous appelons nos dispositifs des chambres microfluidiques mimétiques vasculaires, ou VMMC. Ces dispositifs nous permettent de quantifier les résultats inflammatoires dans les cellules endothéliales et les monocytes dans des conditions qui imitent celles observées dans les vaisseaux athérogènes. Le VMMC facilite l'utilisation de faibles quantités de réactifs ou de matériaux qui peuvent être en quantité limitée.

Ils peuvent également être conçus selon plusieurs configurations et géométries personnalisables, ce qui les rend très adaptés à un large éventail d'applications. Aujourd'hui, nous allons démontrer une expérience représentative en utilisant notre approche de laboratoire sur une puce. Des monocouches endothéliales humaines seront exposées à une activation par des cytokines sous des contraintes de cisaillement bien définies.

Nous allons démontrer l'utilisation de la VMC pour quantifier en temps réel le recrutement des cellules monocytaires humaines vers la monocouche, en tant que paramètre fonctionnel d'activation endothéliale, en utilisant des substrats circulaires de trois pouces usinés à partir de boîtes de culture tissulaire de 100 millimètres. Les substrats de trois pouces sont lavés à l'eau distillée, puis stérilisés par immersion dans de l'éthanol à 70 %. Les substrats stériles sont placés dans des boîtes de Pétri de 100 millimètres et laissés sécher.

Ils sont ensuite incubés avec du collagène de type I à une concentration de 100 microgrammes par millilitre pendant une heure à température ambiante, puis lavés avec du PBS. Les cellules endothéliales de l'aorte humaine, ou HA, sont suspendues à une concentration de 650 000 cellules par millilitre. Un millilitre de suspension cellulaire est déposé en gouttelettes sur un substrat recouvert de collagène séché et étalé pour former une suspension uniforme.

Les substrats en position assise sont ensuite placés dans un incubateur à 37 degrés avec 5 % de CO₂ et laissés pour qu’ils s’attachent à la surface du substrat. Après une heure, neuf millilitres de milieu de croissance EGM-2 sont ajoutés et les cellules sont laissées à croître en monocouches jusqu’à une confluence d’environ 90 %. Les monocouches sont alors prêtes à être utilisées pour les expériences de cisaillement ultérieures. Des chambres microfluidiques mimétiques vasculaires sont construites en coulant un moule en A-P-D-M-S sur une forme maîtresse comprenant la géométrie du canal souhaitée.

La base de silicone est versée dans un bac en plastique, suivie de l'agent de durcissement du silicone dans un rapport de 10 à 1 en poids. Le gel de PDMS est ensuite soigneusement mélangé, en prenant soin de ne pas racler les parois du bac afin d'éviter d'introduire des particules de plastique dans le mélange. Les matrices en photo-résine sont nettoyées à l'hexane et préparées pour mouler le VMMC.

Le mélange de PDMS est ensuite versé sur la forme maîtresse, puis placé dans une chambre à vide. Dans la chambre, l'air est éliminé du mélange de PDMS et remonte à la surface après 15 minutes.

Le moule est retiré de la chambre et de l'air est soufflé doucement sur la surface de PDMS pour éliminer les bulles d'air résiduelles du moule. Le moule est ensuite recouvert et placé dans une étuve à 37 degrés pendant une heure, temps durant lequel le PDMS est laissé à polymériser. Retirer le gel de PDMS solidifié de l'étuve et effectuer des incisions circulaires autour de la chambre à l'aide d'un petit scalpel.

Il est essentiel de procéder progressivement afin d'éviter tout contact avec le matériau de résine photosensible, car cela endommagerait le moule maître. Découper la chambre microfluidique à partir du moule en perforant les entrées et sorties de chaque canal à l’aide d’une aiguille Luer lock de 19 g. Perforer également des trous destinés aux tubes sous vide, en les plaçant à distance des canaux.

La préparation pour la VMMC est maintenant terminée. Pipeter la cytokine pro-inflammatoire TNF alpha dans six millilitres de milieu L 15 pour obtenir une concentration finale de 0,5 nanogramme par millilitre. Le milieu L 15 est utilisé ici comme fluide de cisaillement en raison de sa capacité de tamponnage du pH en l'absence de CO2 à 5 %.

Le milieu est ensuite aspiré dans une seringue stérile de 10 millilitres, utilisée pour charger le dispositif de cisaillement. La monocouche confluente est ensuite transférée vers le dispositif de cisaillement cellulaire, qui a été stérilisé à l'éthanol, mis à niveau et dont la hauteur de l'entrefer du cône a été réglée. Le substrat est retiré de la boîte de Pétri et placé sur le bloc-étalon en verre, centré, puis inséré avec précaution dans la partie inférieure de la chambre d'enceinte, de sorte que le cône se trouve directement au-dessus des cellules.

Le substrat est fixé en resserrant uniformément les vis en acier inoxydable autour du bloc d'étalonnage. Le milieu de cisaillement est ensuite chargé dans la chambre, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d'air. Ensuite, un ordinateur est utilisé pour saisir le programme de contrainte de cisaillement souhaité et le moteur micro séparateur est mis en marche.

Ici, nous utilisons un cisaillement oscillatoire de zéro plus ou moins cinq dynes par centimètre carré. Après quatre heures, le programme de cisaillement est arrêté. Le calet de mesure est retiré et le substrat est replacé soigneusement dans la boîte de Pétri.

Les cellules sont désormais prêtes pour le test d'adhésion des monocytes. Immédiatement après le cisaillement, les monocouches d'acide hyaluronique sont transportées vers la station du microscope pour l'assemblage du VMMC. Le VMMC est raccordé au tuyau de vide et immergé dans de l'eau DI afin d'éliminer toute bulle d'air piégée dans les canaux.

Avec la vanne à vide initialement fermée, la chambre est soigneusement apposée sur la monocouche, puis la vanne à vide est ouverte. Il est essentiel ici de s'assurer qu'aucune bulle d'air n'est piégée dans les canaux de la chambre. Ensuite, 80 microlitres de HBSS contenant du calcium et du magnésium sont pipettés dans un réservoir constitué par la coupe de l'extrémité d'une aiguille Luer Lock de 19 Gauge ; le liquide est expulsé de l'extrémité en appuyant fermement sur le haut du réservoir, qui est ensuite inséré dans le port d'entrée du VMMC.

L'ensemble est placé sur la platine du microscope et la caméra du microscope ainsi que le moniteur vidéo sont allumés. Une seringue en verre de 10 millilitres est chargée sur la pompe à seringue. Ensuite, le tube de la seringue est relié au port de sortie du VMMC.

Le débit est réglé de manière à induire une contrainte de cisaillement d'une dyne par centimètre carré dans le canal, puis est lancé en mode de remplissage, de sorte que la seringue aspire le fluide du réservoir à travers le canal. Les cellules P1 stimulées avec le SDF1 sont suspendues à une concentration de 2 millions de cellules par millilitre. Dans les deux minutes suivant l'activation de l'écoulement, 50 microlitres de la suspension cellulaire sont ajoutés au réservoir.

Encore une fois, veillez à ne pas introduire de bulles d'air lors de l'établissement complet de l'écoulement. La vidéo est enregistrée à raison de trois images par seconde et les données sont quantifiées à l'aide du logiciel Image J. Les cellules THP-1 adhérentes sont définies comme celles qui se déplacent de moins de la moitié de leur diamètre en 10 secondes.

Ici, nous présentons des données illustrant l'adhésion des cellules THP-1 à des monocytes HA stimulés par le TNF alpha et conditionnés soit sous une contrainte de cisaillement pariétal élevée et constante de 15 dines par centimètre carré, soit sous une contrainte de cisaillement oscillatoire de 0 ± 5 dines par centimètre carré. Les monocytes HA conditionnés sous contrainte de cisaillement oscillatoire ont recruté trois fois plus de cellules THP-1 que ceux exposés à une contrainte de cisaillement élevée. Aujourd'hui, nous démontrons l'utilisation de techniques in vitro personnalisables pouvant être combinées pour fournir des informations essentielles sur les premiers événements inflammatoires sous-jacents à l'athérosclérose. Plus précisément, nous quantifions les résultats associés à la dysfonction endothéliale et aux cellules exposées à des stimuli inflammatoires dans des conditions hydrodynamiques bien définies.

L'utilisation de dispositifs CS de VMM nous permet d'examiner les mécanismes spécifiques sous-jacents aux interactions d'adhésion entre les cellules endothéliales et les leucocytes. Ces dispositifs présentent également l'avantage d'être flexibles et peu coûteux, et facilitent l'utilisation de matériaux dont l'approvisionnement peut être limité, comme les composants sériques provenant de sujets humains. Nos études utilisant ces dispositifs ont inclus des investigations sur l'inflammation induite par les cytokines, les lipides et RAGE dans les cellules endothéliales.

Nous avons également mis au point des tests sur puce permettant d'étudier les mécanismes d'adhésion dans plusieurs types de leucocytes ainsi que dans le sang total. En définitive, nous envisageons que cette technologie conduise à des approches ex vivo pour évaluer le risque individuel de maladie cardiovasculaire induite par l'inflammation.